摘要
蓝莓属杜鹃花科（Ericaceae）越橘属（Vacciniumspp.）多年生灌木或小灌木，因其富含花青素等功能成分而备受关注，近年来南方省份蓝莓种植面积也发展迅猛。蓝莓根表面不被根毛，其营养吸收主要依赖与蓝莓共生的菌根真菌，但蓝莓与内生菌的共生机理及内生菌的开发利用仍缺乏系统研究。 本研究通过分离纯化并筛选鉴定出具有促进蓝莓生长的内生菌根真菌；分析内生菌根真菌促进蓝莓生长发育的机理；内生菌回接后，利用荧光定量PCR分析蓝莓的PHT1基因表达模式，并克隆其cDNA全长，通过转基因拟南芥验证其功能，以期为蓝莓的现代化生产栽培提供理论基础及新的思路。主要研究结果如下： 以‘夏普蓝’、‘奥尼尔’以及‘杰兔’5年实生苗根系为材料，通过根段分离纯化、ITS序列扩增对三种蓝莓的根系内生真菌进行鉴定，并经过筛选后对蓝莓‘明星’组培苗进行回接实验。结果显示，从‘奥尼尔’、‘夏普蓝’和‘杰兔’根系中分离并鉴定了共15个菌株，其中除X5和X10的分类地位尚不清楚外，4株为镰刀菌属（Fusarium），6株为青霉菌属（Penicillium），1株为曲霉菌属（Aspergillus），1株为踝节菌属（Talaromyces），1株为赤霉菌属（Gibberella）。本次分离出的真菌93%为子囊菌，说明子囊菌为蓝莓菌根真菌资源中的优势资源，符合杜鹃花类菌根真菌以子囊菌为主相的特性。回接试验表明X2、X6、X11、X24、A2、A4这6株真菌接种蓝莓后，能显著促进蓝莓生物量生长。 接种内生真菌后，对其进行真菌侵染观察、根际pH测定，根系活力测定、蓝莓根茎叶的氮磷含量测定及PHT1基因家族的基因表达模式研究。结果显示6种真菌与蓝莓根系接触后均能形成内生菌根结构，且不同程度地提高了蓝莓的根系活力，其中X6、X11、X24的提升效果最为显著，增幅分别为对照组的94.52%、127.61%、125.87%。同时，促生菌根真菌接种处理组不同程度地提高了蓝莓根茎叶氮磷含量，增幅为11-49%，说明真菌接种后扩大了蓝莓根系吸收营养元素的吸收面积，提高了对于氮磷元素吸收效率。荧光定量PCR实验结果表明PHT1-1~PHT1-4在蓝莓叶及根内部均呈现不同程度的上调或下调，说明这些基因的表达模式是具有组织特异性的，PHT1-1在真菌接菌后的蓝莓根内表达均为上调，且蓝莓根部磷含量都有提高；PHT1-2基因在真菌处理组蓝莓叶片内也表达均为上调，且蓝莓叶片磷含量也得到显著提高；PHT1-4、PHT1-3基因除A4处理组外较对照组根内表达均为上调，推测真菌与蓝莓结合形成菌根结构后扩大了根系对磷元素的吸收范围，对基因产生了特异性的影响。另外，不同真菌处理组4个基因表达量存在不同程度的差异，推测不同真菌形成菌根结构的数量、范围、大小等差异对于基因的诱导能力存在着影响。 以蓝莓的cDNA为模板成功克隆得到PHT1-1、PHT1-2、PHT1-3、PHT1-4的全长序列，序列长为1611、1611、1617、1005bp，分别编码由537、537、539及335个氨基酸残基组成的蛋白，等电点分别为8.87、8.87、6.57及8.35。进行构建分析其进化树并比对氨基酸序列后，发现PHT1-1、PHT1-3与原木杜鹃亲缘性较近，PHT1-2、PHT1-4分别与中华猕猴桃、茶树等物种亲缘性较近。利用TMHMM分析结果显示PHT1-1、PHT1-2、PHT1-3及PHT1-4分别可能存在12、12、12、6个跨膜结构域，属于膜蛋白。 通过遗传转化拟南芥实验，进一步验证PHT1-1及PHT1-3具有吸收转运磷元素的功能。野生型拟南芥在低磷条件下，显现出植株发育矮小，叶盘小、叶片数量少及生命活力低等现象，而PHT1-1及PHT1-3的过表达则显著减轻了这些生长抑制现象，说明PHT1-1及PHT1-3可能具有磷元素的吸收转运功能以此来缓解植物体缺磷带来的症状，但仍需进一步研究确定。
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