摘要
进化上保守的Argonaute（AGO）蛋白的重要性因其在小分子RNA（smallRNA，sRNA）介导的RNA干扰（RNAi）途径中所扮演的角色而被熟知。作为RNA诱导沉默复合体（RISC）的核心蛋白，AGO在RNAi中通过剪切靶向互补mRNA、翻译抑制、DNA甲基化等方式发挥作用，从而在转录后基因沉默（PTGS）或转录基因沉默（TGS）这两个水平上调控基因表达。更有趣的是，近期在动物中的研究表明，AGO蛋白还参与了可变剪接机制（alternativesplicing，AS）。那么，植物当中的AGO蛋白是否也在RNA剪接中起作用？带着这样一个问题的启发，我们在拟南芥（Arabidopsisthaliana）中寻找需要依赖AGO蛋白活性而被切除的内含子。 本研究以模式植物拟南芥为研究材料、AGO1/4蛋白为研究对象，揭示了拟南芥中AGO1/4参与转录本加工成熟过程中内含子移除的普遍性；揭示了依赖于AGO1/4活性的内含子移除过程的组织/器官特异性；探明了AGO1/4在转录本内含子滞留（intronretention，IR）剪接位点附近的结合情况；解析了与AGO1/4互作的功能蛋白。总的结果可概括为以下几个方面： 1.ago1/4突变体中IR的搜寻及器官特异模式分析： 据RNA-seq数据分析揭示，在ago1和ago4突变体中分别存在着数百个上调或下调的内含子。这表明，在拟南芥内含子切除过程中，对于不同的基因，AGO蛋白可能起着积极或消极的作用。我们注意到一些内含子由其中单一AGO蛋白特异性调节，而一些则同时受到两种蛋白的调节。此外，其中很大一部分的内含子在根或芽中被特异性调节。 2.半定量RT-PCR验证内含子差异表达: 半定量RT-PCR结果表明，在选取的15个含有AGO1依赖性内含子的基因中，有7个基因的验证结果与预期的情况相符合；在选取的20个含有AGO4依赖性内含子的基因中，有9个基因的验证结果与预期的情况相符合。电泳图结果有力地验证了AGO1/4蛋白参与可变剪接的可能性。 3.全转录组水平探测AGO蛋白与RNA的结合： RIP-seq表明，两个蛋白都会优先结合到内含子区域，共有468个和1,057个内含子分别被鉴定为AGO1和AGO4的靶标，体现了二者对内含子结合的亲和力。然而，这些AGO1/4靶向的内含子在AGO突变体中差异表达的却分别只有15个和33个，这表明某些AGO依赖性的内含子加工可能是通过间接的AGO-RNA关联来调节。 4.搜索与AGO1/4互作的蛋白质： 通过IP-MS分析以鉴定可能与这两种AGO蛋白相互作用的蛋白质。结果，新揭示了6个参与mRNA结合的相互作用因子（其中有两个与AGO1相互作用，而其他四个能与两个蛋白相互作用），这一发现可能有助于加深对AGO-内含子之间相关性的了解。 总之，基于对RNA-seq、RIP-seq、IP-MS/LC-MS的整合分析，我们的结果指出了植物AGO在内含子加工中的新作用，为进一步研究AGO介导的植物pre-mRNA加工和可变剪接的详细分子机制提供参考。
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