摘要
研究背景与目标 肺癌是最常见的恶性肿瘤之一。包括肺癌在内的许多恶性肿瘤的发生和发展与核糖体的功能失调有关。有关研究已证实：多种核糖体蛋白基因的表达在肺恶性肿瘤中上调，且核糖体蛋白基因的高表达与肺癌患者的不良预后相关。核糖体蛋白还被证明具有调控肿瘤细胞的生物学行为或肿瘤相关信号通路的功能。RPL32是核糖体蛋白之一，过去的研究显示它能促进多种恶性肿瘤的发生与发展。但到目前为止，它在肺恶性肿瘤发生发展中的作用及其机制尚不明确，为此，本课题从以下三个方面开展研究： 一、通过体外实验研究RPL32基因在肺癌细胞中的作用与机制。 二、研究RPL32-p53调控通路的关键基因在肺癌中的表达，以及这些基因的表达与肺癌患者预后的相关性。本课题研究了肺腺癌和肺鳞状细胞癌中，RPL32-p53调控通路关键基因的表达情况及其与患者预后的相关性。因为p53突变是肺癌中最常见的遗传变异之一，且突变型p53蛋白与野生型p53蛋白的结构与功能差异很大，为此，本课题研究了p53突变型肺癌与p53野生型肺癌之间，RPL32-p53调控通路关键基因的表达及这些基因与患者预后的相关性是否存在差异。 三、研究RPL32-p53调控通路关键基因表达情况与肺癌免疫浸润和免疫功能的相关性。既往研究证实：在肺癌组织中，免疫细胞的浸润、免疫检查点基因的表达和重要的细胞因子信号通路的活性等三个因素与肺癌的发生发展和肺癌患者的 预后密切相关。之前的研究还证实了核糖体蛋白与p53蛋白参与了肺癌免疫功能的调控。为此，本课题研究了肺癌中RPL32-p53调控通路关键基因的表达是否与免疫细胞的浸润、免疫检查点基因的表达和重要细胞因子信号通路的活性三个因素存在相关性。 研究方法 一、通过免疫组织化学染色研究： （1）RPL32基因在肺癌组织与癌旁组织之间表达的差异； （2）RPL32基因的表达与肺癌患者预后的相关性。 二、通过基于siRNA的沉默策略敲低了几种肺癌细胞系中RPL32基因的表达。在此基础上，通过蛋白免疫印迹分析、细胞周期分析、实时定量PCR分析、免疫共沉淀分析等研究RPL32在肺癌细胞中的作用及其机制。 三、通过生物信息学方法分析RPL32-p53调控通路的关键基因在肺癌中的以下特征： （1）差异表达； （2）共表达； （3）蛋白相互作用； （4）基因表达与患者预后的相关性。 并研究肺腺癌与肺鳞状细胞癌之间及p53突变型肺癌与p53野生型肺癌之间这些特征的差异。 四、通过生物信息学方法分析肺腺癌组织中参与RPL32-p53调控过程的关键基因的表达与以下因素的相关性： （1）免疫细胞的浸润水平； （2）免疫检查点基因的表达； （3）重要的细胞因子信号通路的活性。 研究结果 一、通过免疫组织化学分析与体外细胞实验得到如下结果： （1）RPL32基因的表达在肺癌组织中上调（Plt;0.01），且RPL32基因的高表达与肺癌患者的预后不良相关（P=0.0247）。 （2）RPL32基因的高表达在体外促进了肺癌细胞的增殖，并使肺癌细胞中的p53蛋白水平降低。 （3）RPL32基因的高表达在肺癌细胞中增强了MDM2介导的p53泛素化，从而促进了p53蛋白的降解。 （4）在肺癌细胞中敲低RPL32基因的表达引发了核仁应激，使核糖体蛋白RPL5与RPL11由核仁向核质转移。RPL5和RPL11能够结合MDM2，从而阻断MDM2与p53蛋白的相互作用，使p53蛋白在细胞中积累，最终导致肺癌细胞的增殖被抑制。 二、通过差异表达分析、共表达分析、蛋白互作分析与生存分析得到如下结果：（1）RPL32、RPL5、RPL11、RPL23、MDM2、MDM4和TP53等7个基因参与了RPL32对p53蛋白的调控。 （2）肺腺癌组织中RPL32、RPL5、RPL23、MDM4和TP53基因的表达显著高于正常肺组织（Plt;0.01）；肺鳞状细胞癌组织中RPL5、RPL23、MDM4和TP53基因的表达高于正常肺组织（Plt;0.05）；而肺鳞状细胞癌组织中RPL11基因的表达低于正常肺组织（Plt;0.01）。 （3）p53野生型肺腺癌中RPL32、RPL11、RPL23、MDM2、MDM4和TP53基因的表达高于p53突变型肺腺癌（Plt;0.05）；p53野生型肺鳞状细胞癌中RPL32基因的表达高于p53突变型肺鳞状细胞癌（Plt;0.01）。 （4）肺腺癌与肺鳞状细胞癌组织中RPL32、RPL5、RPL11和p53蛋白的水平高于正常肺组织。肺腺癌组织中RPL23蛋白的水平高于正常肺组织。肺鳞状细胞癌组织中MDM4蛋白的水平高于正常肺组织。 （5）肺腺癌与肺鳞状细胞癌中RPL32-p53调控通路关键基因的表达相关性不同。p53野生型肺腺癌与p53突变型肺腺癌中RPL32-p53调控通路关键基因的表达相关性不同。p53野生型肺腺癌中p53基因的表达分别和RPL32、RPL5、RPL23与MDM4基因的表达正相关（Plt;0.05）。 （6）p53蛋白可与其他RPL32-p53调控通路蛋白相互作用。 （7）RPL32、RPL11、RPL23和TP53基因的高表达与肺腺癌患者更差的总体生存相关（Plt;0.05）。RPL32-p53调控通路全部关键基因的表达与肺鳞状细胞癌患者的总体生存无关。肺腺癌RPL32基因低表达患者中p53野生型的预后好于p53突变型（P=0.033），而肺腺癌RPL32基因高表达患者的预后与p53突变状态无关。 三、通过RPL32-p53调控通路关键基因的表达与肺癌免疫浸润和免疫功能的相关性分析得到如下结果： （1）肺腺癌中RPL32-p53调控通路关键基因的表达与多种免疫细胞的浸润水平相关（Plt;0.05）。 （2）RPL32通过调控p53影响免疫检查点功能。肺腺癌中免疫检查点基因的表达与RPL32-p53调控通路关键基因的表达和p53突变状态相关（Plt;0.05）。 （3）肺腺癌中RPL32-p53调控通路关键基因的表达水平与IL-4、IL-13、TGF-β、核心血清反应等细胞因子信号通路活性相关（Plt;0.05）。 研究结论 一、RPL32通过增强MDM2介导的p53泛素化和降解促进肺癌的发生发展。 二、RPL32、RPL5、RPL11、RPL23、MDM2、MDM4与TP53等7个基因参与了RPL32对p53的调控。 三、RPL32-p53调控通路的激活促进了肺腺癌的发展。 四、p53野生型肺癌中RPL32对p53的调控活性强于p53突变型肺癌。 五、肺腺癌中RPL32-p53调控通路关键基因的表达与组织中免疫细胞的浸润、免疫检查点基因的表达和重要的细胞因子信号通路的活性相关。
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