摘要
副猪嗜血杆菌(Haemophilusparasuis,HPS)是猪呼吸道的一种常在菌，属于条件致病菌，主要感染断奶仔猪和保育阶段的猪，是影响我国养猪业的主要细菌性病原之一。副猪嗜血杆菌病感染猪的临床症状表现为发病猪体温升高、呼吸困难、跛行等，剖检可见多发性浆膜炎、肺炎、脑膜炎和关节炎等，发病率一般在10%-15%，严重时死亡率可达50%。除了能直接感染造成猪群发病外，HPS经常与猪繁殖与呼吸综合征病毒、圆环病毒、猪流感病毒等病毒性病原以及猪链球菌等细菌性病原混合感染，给猪病的诊断和防治带来了更大的困难。目前，HPS的防控主要靠疫苗免疫和药物治疗。由于HPS血清型众多，已有的商品化疫苗缺乏有效的交叉保护力。同时，HPS临床菌株的耐药性日益严重。因此，研发新型的抗副猪嗜血杆菌病的手段具有重要意义。利用抗病相关基因培育具有抗病能力的转基因动物是防控传染病的有效手段之一。防御素是一类广泛分布于动植物中的内源性阳离子小肽，具有抗细菌、真菌和病毒感染及免疫调节等多种生物学活性。其中的猪β防御素2(PBD-2)是猪体内的重要防御素之一，在体外具有广谱的抗菌活性。本实验室前期已成功制备了PBD-2过表达转基因猪，证实了转基因猪对猪的重要呼吸道病原菌胸膜肺炎放线杆菌具有抵抗力。本研究从体外水平和PBD-2转基因动物水平两个方面，对PBD-2抵抗HPS的作用进行了评估，主要研究结果如下： 1.PBD-2在体外对副猪嗜血杆菌(HPS)增殖的影响 用HPS血清5型临床分离菌株SH0165在体外检测了PBD-2对HPS的杀菌活性，将5×103CFU的HPS与浓度分别为25、50、100和200μg/mL的PBD-2混合，在37℃孵育1h后，将混合物中存活的HPS进行细菌计数。结果表明，当PBD-2浓度达到25μg/mL时即可抑制HPS的生存，且抑制作用随浓度升高而增强。 2.PBD-2过表达转基因猪的抗HPS效果评估 同居感染的条件的确定：将仔猪通过气管注射方式感染2×1010CFUHPSSH0165（直接感染组），然后将同等数量的仔猪与其混合（同居感染组），通过检测直接感染和同居感染猪的体温、临床症状、大体病变程度、肺和脑组织的HPS分离率，证明了直接感染和同居感染猪都能表现出典型的HPS感染症状，并从组织中分离到HPS。 PBD-2过表达转基因猪的抗HPS效果评估：通过上述同居感染方式，比较了PBD-2过表达转基因猪及同窝野生型猪对HPS的敏感性。结果表明，转基因猪在细菌感染后24小时的体温显著低于同窝野生型猪。感染4天后剖杀实验猪，发现转基因猪的临床症状、大体病变程度、肺和脑组织病变程度均显著低于同窝野生型猪。对肺部组织和脑部组织进行匀浆后进行组织载菌量的测定，发现转基因猪肺部和脑部的载菌量显著低于同窝野生型猪的组织载菌量。进一步检测了猪肺组织匀浆液及脑组织匀浆液对HPS的抑菌活性，发现转基因猪的肺组织以及脑组织匀浆液对HPS的抑制效果显著高于同窝野生型猪的组织匀浆液。上述结果证明，与野生型猪相比，PBD-2过表达转基因猪对HPS的抵抗能力显著增强，转基因猪的组织匀浆液具有显著的抑制HPS生存的效果。 本研究从PBD-2的体外抑菌活性和PBD-2过表达转基因猪的抗病能力两个方面，证明了PBD-2对副猪嗜血杆菌的抵抗作用，为副猪嗜血杆菌的防控策略提供了新的思路，也为培育抗病性良好的转基因新材料奠定了基础。
NETL