摘要
植物通过光合作用制造能量产生营养物质，不仅维持自身的生长活动，同时为人类和动物提供食物，而叶绿体是植物进行光合作用的主要细胞器。叶色突变体的产生可能是由于参与叶绿素合成降解、质核信号传导、光形态建成以及叶绿体分化等多个重要途径的基因发生变异，是研究叶绿体的理想材料。本课题在甘蓝型油菜恢复系轮回选择群体的单株自交后代中，发现一株黄化致死突变体，将其命名为ytl（yellowtolethal），对该突变体的表型进行考察，分析遗传模式，对突变位点完成精细定位，结果如下： 1.黄化致死突变体ytl来自轮回亲本群体中的单株自交后代，与同株系的正常单株相比，该突变体自播种之后，子叶一直处在黄化阶段，后期不转绿，不能长出真叶，播种9-15d后死亡。选取播种7d的野生型和突变体ytl的子叶，我们进行光合色素的含量测定和叶绿体透射电镜观察，结果显示黄化致死突变体的光合色素含量均显著低于野生型植株。与野生型植株细胞相比，在突变体细胞中，脂肪粒的含量较稀疏，叶绿体发育不良仍处在质体阶段，并且结构较模糊，类囊体垛叠数较少，没有形成片层结构，基粒稀疏。 2.对杂合单株进行套袋自交，考察其性状分离比，结果表明正常单株数与突变单株数之比为275∶104，符合3∶1的分离比（x2=1.20＜x20.05,1=3.84）。由于甘蓝型油菜是双二倍体，利用杂合单株与ZS11杂交，后代收获的8个F2株系中有4个株系出现性状分离，3个株系分离比符合15∶1（x2＜x20.05,1=3.84），1个株系出现偏分离现象。初步判断该性状为2个核基因控制的隐性性状。 3.利用BSA结合甘蓝型油菜60KSNP芯片的方法，对突变位点进行初定位分析，芯片结果显示黄化单株与野生型单株的SNP差异主要集中在C09和C02染色体上，根据ZS11参考基因组序列在差异区段内均匀地设计SSR引物，对自交S1群体和自交S2群体中的突变体和正常植株分别混池进行多态性标记筛选，最终将两个候选基因分别定位到C09染色体和C02染色体上，并命名为BnaC09.YTL和BnaC02.YTL。 4.选用S1群体中777株黄化致死单株对BnaC09.YTL进行精细定位，最终将BnaC09.YTL定位于标记SSR-140和PBZIN-1之间，对应ZS11的198kb物理区间内，区间内含有10个注释基因。利用qRT-PCR的方法，选取突变体和野生型的子叶，分析10个候选基因表达量的差异。结果显示，第4个和第10个基因在子叶时期不表达，第2个、第3个、第5个和第7个基因的表达量在突变体中和正常植株相比具有极显著性差异，并且8个候选基因的表达量均下调表达。 5.以突变体和正常植株为模板，扩增10个候选基因的序列，之后对碱基序列比较测序。结果表明，第4到第10个基因之间在野生型和突变体植株中没有序列差异，将候选基因缩小至前3个基因。 6.根据甘蓝型油菜60KSNP芯片显示的C02染色体上SNPs富集结果，在C02染色体3-10Mbp上均匀地设计SSR引物共41对，使用S2群体中的黄化致死单株混池和正常单株混池对标记进行多态性标记筛选，选择多态性标记进行小群体验证。设计的41对引物共筛选到到25对可用的多态性标记，并且多态性标记均位于同侧，对应ZS11基因组CO2染色体上3-6Mbp的位置。
NETL