摘要
拟禾本科根结线虫（Meloidogynegraminicola）是水稻上一类重要土传病原物，导致水稻严重减产。根结线虫通过分泌效应因子和劫持宿主基因在宿主根中建立取食位点（Nematodefeedingsites,NFSs）—巨型细胞（Giant-cells，简称为GCs），确保线虫自身营养供给。丝裂原活化蛋白激酶（MAPK或者称为MPK）级联途径广泛参与植物生长发育和抗逆性反应等生物学过程，植物通过复杂的信号通路激活蛋白激酶，蛋白激酶进一步磷酸化修饰目标蛋白以协调不同的细胞反应过程，将生物和非生物信号转化为适当的细胞反应与许多信号途径交互作用。目前，MPK级联途径在植物与拟禾本科根结线虫互作机制中的功能有待解析。本研究通过组织透明化处理和细胞三维重构技术表征了拟禾本科根结线虫NFSs的全时空三维（3D）结构和细胞质密度差异，探究拟禾本科根结线虫NFSs膨大生长和发育进程。同时，以水稻MPK5超表达和基因沉默转基因水稻株系为植物材料，评价水稻中MPK5稳态失衡对水稻与拟禾本科根结线虫互作表型的影响，并初步探讨MPK5的作用机制。主要研究结果如下： 1．采用激光共聚焦显微镜技术获取拟禾本科根结线虫NFSs连续完整光学切片，采用软件Fiji重构线虫取食位点3D结构。比较p-J2后期、J3、J4和雌虫成虫期拟禾本科根结线虫NFSs的3D结构、体积以及NFSs横向和纵向截面积差异。试验结果表明，依据NFSs的3D结构差异可将拟禾本科根结线虫NFSs区分为Ⅰ型、Ⅱ型和Ⅲ型。其中，I型为各发育时期NFSs主要类型，在p-J2后期、J3、J4和雌虫成虫期占比依次为45.5%、84.4%、88.9%和90.2%；Ⅲ型占比最少，Ⅱ型在J3时期通过纵向生长转变为Ⅰ型。此外，拟禾本科根结线虫NFSs横向和纵向膨大生长分别在p-J2后期和J4期终止，NFSs平均体积在J4期达到2.69×106μm3。 2．以各发育时期拟禾本科根结线虫NFSs为研究对象，比较分析了各时期NFSs光学切片中的绿色荧光强度，据此评价GCs间细胞质密度差异。试验结果显示，在p-J2早期的中间时期和雌虫成虫时期GCs细胞质密度达到峰值，且在雌虫成虫期GCs细胞质密度最大。NFSs膨胀生长终止期早于GCs细胞质密度达到最大峰值期，表明拟禾本科根结线虫NFSs极性生长与其细胞发育成熟不同步。 3．以水稻MPK5超表达和沉默水稻株系为植物材料，以水稻日本晴野生型为对照，通过线虫侵染试验发现，与野生型相比超表达和沉默MPK5均导致水稻根结数和根内线虫数量减少。在接种线虫3天后（3dpi）其平均单株根结数从11个分别减少至1个和0个，其平均单株线虫数均从22头减少至0头，在10dpi则从13个分别减少至1个和2个，平均单株线虫数从25头分别减少至1头和4头。这表明，水稻中MPK5稳态失衡抑制拟禾本科根结线虫与水稻的亲和互作。 4．实时定量PCR分析结果显示，与水稻野生型不同，在MPK5超表达和沉默水稻株系中MPK5均受拟禾本科根结线虫诱导表达，在3dpi相对表达量依次为41.8倍和9.0倍。同时，拟禾本科根结线虫可抑制MPK5超表达株系中几丁质酶的表达，但诱导MPK5沉默株系中病程相关基因PR5与PR10的表达。上述试验结果表明，MPK5稳态失衡可导致MPK5参与响应拟禾本科根结线虫的侵染，且在MPK5超表达和沉默水稻株系中MPK5介导水稻产生拟禾本科根结线虫抗性的机制不同。
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