摘要
死体营养型病原真菌灰葡萄孢（Botrytiscinerea）的寄主范围广，由其引起的灰霉病在农作物上普遍发生且危害严重。由于灰葡萄孢极易产生抗药性，化学防治成本高，创建高效绿色的防治技术十分重要。利用真菌病毒防治作物病害是生物防治理论和实践的重要组成部分，筛选获得引起致病力衰退的真菌病毒是利用其防治病害的前提。本文对来自以色列患灰霉病草莓（Fragariaananassa）上的一株弱致病力灰葡萄孢菌株IBc-230携带的病毒进行了研究，并通过RNA-Seq在转录组水平上分析了病毒与寄主的互作，主要研究结果如下。 菌株IBc-230被10种病毒共同感染，包括9种+ssRNA病毒和1种dsRNA病毒，同时还携带1种卫星RNA。+ssRNA病毒分别是：2种番茄丛矮病毒科病毒BcULV1/IBc-230和BcULV2（BcULV2是Tombusviridae科的1种新的病毒），减病毒BcHV1/IBc-230及其卫星RNA，4种线粒体病毒BcMV1/IBc-230、BcMV3/IBc-230、BcMV9/IBc-230和SsMV4/IBc-230，1种葡萄孢欧尔密病毒PVLAOLV80/IBc-230及1种丁型线性病毒SsDFV2/IBc-230；dsRNA病毒是Curvulaviridae科的1种新的病毒，暂命名为灰葡萄孢双分病毒样病毒1（BcPLV1）。 利用RACE法克隆获得了BcPLV1的基因组全长序列，其中RNA1全长2026bp，含1个ORF，编码606aa的蛋白，含1个保守的RdRp结构域；RNA2全长为1618bp，含2个ORF，分别编码306aa和122aa的蛋白。两条链5’UTR的前22个核苷酸严格保守，序列相似性100%。BcPLV1与寄生隐丛赤壳菌双节段真菌病毒1（Cryphonectriaparasiticabipartitemycovirus1，CpBV1）具有最近的亲缘关系，它们RdRp的一致性为59.83%。对BcPLV1的RdRp氨基酸序列进行系统发育分析，发现BcPLV1隶属于病毒科Curvulaviridae。BcPLV1的病毒粒子呈球形，直径50nm左右。BcPLV1不易通过分生孢子进行垂直传播，但在其他的菌株中，如菌株IBc-207中，也检测到BcPLV1的存在。 BcULV1/IBc-230、BcULV2、BcMV3/IBc-230、BcMV9/IBc-230、BcHV1/IBc-230、PVLAOLV80/IBc-230和SsDFV2/IBc-230等7种病毒能通过菌株IBc-230的dsRNA或总RNA转染至灰葡萄孢菌株B05.10。BcULV1/IBc-230、BcULV2、BcMV3/IBc-230和PVLAOLV80/IBc-230对B05.10的生长速度无显著影响，但可以推迟菌核形成和成熟，BcULV1/IBc-230可以降低菌株B05.10的致病力。 对菌株IBc-230进行单孢分离，获得了分离物IBc-230-26，形态异常、生长缓慢，该菌株携带9种病毒，脱除了BcPLV1。相对于菌株IBc-230，IBc-230-26中的BcULV1/IBc-230、BcMV1/IBc-230、BcMV3/IBc-230、SsMV4/IBc-230、BcMV9/IBc-230和BcHV1/IBc-230等6种病毒的含量增高。对IBc-230-26继续单孢分离，获得分离物IBc-230-26-16，该分离物生长速度较快，只携带4种病毒，脱除了BcULV1/IBc-230、BcULV2、SsMV4/IBc-230、SsDFV2/IBc-230和PVLAOLV80/IBc-230等5种病毒。用菌丝悬液接种番茄叶片的方法比较了它们的致病力，发现IBc-230和IBc-230-26-16致病力没有显著区别，IBc-230-26几乎丧失了致病力。推测是菌株IBc-230-26中病毒含量和种类的增多与其致病力降低有关。 将IBc-230、IBc-230-26和IBc-230-26-16的菌丝悬液接种番茄叶片，分别于0h、12h、24h和36h收集叶片上的菌丝并提取RNA进行RNA-Seq分析。发现相对于IBc-230，IBc-230-26中4种线粒体病毒、BcULV1/IBc-230和BcHV1/IBc-230含量的显著增高，使寄主侵染阶段1705个基因上调表达，1500个基因下调表达，其中所有侵染阶段共同上调的基因298个，下调的基因164个；相对于IBc-230-26-16，IBc-230-26中多携带BcULV1/IBc-230、BcULV2、SsMV4/IBc-230、SsDFV2/IBc-230和PVLAOLV80/IBc-230等病毒引起寄主2153个基因上调表达，2027个基因下调表达，其中共同上调的基因499个，下调的基因453个。通过GO注释发现IBc-230-26中上调基因主要与催化活性和结合相关功能有关，下调基因主要与转运相关；KEGG富集发现病毒引起了寄主淀粉（糖原）和蔗糖等代谢途径变化，激发了次生代谢产物的生物合成，抑制了部分参与蛋白质合成的氨基酸。 参照灰葡萄孢B05.10或T4菌株中已鉴定的部分致病因子以及同源于其他病原菌致病因子的基因，对3株菌株中的基因表达量进行了分析。转录组数据结果表明菌株中病毒含量和种类的增多主要引起了IBc-230-26部分生长、产孢和细胞壁降解酶类等相关基因的下调表达，大部分分泌蛋白和次级代谢产物合成相关基因表达模式发生了改变，具有抗病毒活性的次级代谢物被诱导。 总之，本文从菌株IBc-230中检测到10种真菌病毒，其中2种为新的病毒；利用分生孢子单孢分离技术从IBc-230菌株中分离获得了具有低毒特性的菌株IBc-230-26，并通过单孢分离技术从IBc-230-26中获得了恢复致病力和产菌核特性的菌株IBc-230-26-16。利用RNA-Seq比较IBc-230，IBc-230-26和IBc-230-26-16三个菌株的转录组，筛选到与灰葡萄孢生长、产孢和致病等相关的基因。研究结果对深入了解真菌病毒的多样性和生态学特性具有促进作用，有助于理解多种真菌病毒与寄主真菌之间的相互作用，并从这种互作层面深入了解灰葡萄孢的生长发育和致病机制，同时也为灰霉病的生物防治提供真菌病毒资源。
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