摘要
猪链球菌(Streptococcussuis,S.suis)是一种重要的人畜共患病病原，不仅对世界范围内养猪产业造成巨大经济损失，也对公共卫生安全造成严重威胁。猪链球菌感染后可导致多种疾病，包括链球菌中毒休克样综合征(StreptococcalToxicShockLikeSyndrome,STSLS)、脑膜炎和败血症等。1998年和2005年猪链球菌在我国造成了两次流行，共导致240人感染和53人死亡，其中97.4%的死亡病例表现为STSLS。此外，脑膜炎是猪链球菌感染后最常见的致病特点。因此，阐明猪链球菌导致STSLS和脑膜炎的机制，对于猪链球菌病的防控具有重要意义。 前期研究发现猪链球菌2型序列7型(Sequencetype7,ST7)高毒力菌株SC-19可以通过高表达溶血素(Suilysin，SLY)激活NLRP3炎性小体，导致以炎性因子风暴、多组织器官损伤及高死亡率为特征的STSLS。SC-19由ST1型菌株(P1/7)逐渐进化而来，且比P1/7菌株具有更高的溶血素活性，但是基因组进化过程中获得高溶血活性是否是SC-19突然导致STSLS的关键原因仍有待阐明。NLRP3活化后可以激活IL-1β和IL-18，并进一步诱导IL-17A的表达，但NLRP3活化后是如何通过下游的IL-1β、IL-18和IL-17A等因子导致STSLS还有待解析。除此之外，IL-17A在猪链球菌所致脑膜炎中高水平表达，且IL-17A在破坏机体组织屏障系统方面具有潜在作用，因此其在猪链球菌脑膜炎中的作用和机制也值得深入探讨。针对如上科学问题，本研究开展了P1/7高表达溶血素致STSLS效应的研究，以解析获得高水平的溶血素活性是否是SC-19导致STSLS的关键原因；分析了NLRP3下游的效应因子IL-1β、IL-18和IL-17A在STSLS中的作用，以解析NLRP3是通过哪些下游因子导致STSLS；还针对IL-17A潜在的突破机体组织屏障的功能，研究了IL-17A在猪链球菌脑膜炎中作用和机制。主要研究结果如下： 1、ST1菌株通过SLY的高表达激活NLRP3炎性小体导致STSLS。 为了分析获得高溶血活性是否是SC-19突然导致STSLS的关键原因，本研究以SLY低表达的ST1菌株P1/7为基础，通过电转化SLY表达质粒构建SLY高表达菌株P1/7-SLY，并同时构建了高表达SLY活性突变的菌株P1/7-mSLY和质粒对照菌株P1/7-Vec。通过分析菌株的溶血活性，发现P1/7-SLY溶血活性明显高于P1/7-mSLY和P1/7-Vec，并且与高致病性猪链球菌2型ST7菌株SC-19的溶血活性相当。随后利用THP-1细胞模型研究在猪链球菌感染过程中SLY高表达菌株对炎性小体的激活情况，结果显示P1/7-SLY可以导致THP-1细胞中炎性小体的高水平激活，包括pro-caspase-1、pro-IL-1β和GSDMD的切割，以及高水平的IL-1β分泌和细胞死亡，并且这一过程依赖于NLRP3信号。相反，P1/7-mSLY和P1/7-Vec菌株不能高水平激活炎性小体。此外，通过小鼠感染实验进一步表明，与SC-19相似，P1/7-SLY感染野生型小鼠后能够引起炎性因子风暴、多组织器官功能损伤和小鼠的急性死亡，而感染nlrp3?/?小鼠后不能引起STSLS。相比之下，P1/7-mSLY在野生型小鼠和nlrp3?/?小鼠中均不能引起STSLS。说明SLY高表达的P1/7可以导致NLRP3炎性小体的激活，从而进一步引起细胞因子风暴和STSLS。表明获得高水平的溶血素活性是SC-19导致STSLS的关键原因。 2、IL-18是猪链球菌2型激活NLRP3炎性小体后导致STSLS的关键因子。 在猪链球菌致STSLS中，NLRP3炎性小体激活导致高水平的IL-18。为了探究IL-18在猪链球菌致STSLS中的作用，本研究利用SC-19感染IL-18受体基因缺失小鼠(il18r1?/?)和野生型小鼠，发现IL-18受体缺失可以显著改善猪链球菌感染所引起的组织器官损伤，并提高小鼠的存活率。此外，我们发现虽然il18r1?/?小鼠和野生型小鼠感染猪链球菌后体内组织载菌量水平基本一致，但是IL-18受体的敲除可以显著降低感染诱导的IL-17A和IFN-γ等细胞因子的水平。说明IL-18信号的缺失可以有效地抑制猪链球菌所致的炎性因子风暴和多器官损伤，并降低小鼠的死亡率。表明IL-18是猪链球菌感染激活NLRP3炎性小体后导致STSLS的关键因子。 3、IL-17A在猪链球菌2型感染中有助于细菌的清除，但并未在STSLS中发挥主要效应。 猪链球菌感染激活NLRP3炎性小体后主要通过下游的IL-18调控IL-17A的表达，但IL-17A在STSLS中的作用还有待进一步阐明。本研究利用SC-19感染il17a基因敲除小鼠(il17a?/?)，发现il17a?/?小鼠的临床症状和死亡率同野生型小鼠相比无明显差异，但血液中炎症因子和组织载菌量水平反而升高。说明IL-17A不是猪链球菌2型致STSLS的关键效应因子，甚至在猪链球菌感染早期发挥一定的控制感染的作用。为了进一步分析IL-17A在控制猪链球菌感染中的作用，本研究对感染小鼠血液中性粒细胞数量和抗菌肽水平进行分析，结果显示感染的il17a?/?小鼠血液中性粒细胞和抗菌肽的水平显著降低。说明IL-17A在猪链球菌感染早期通过介导免疫细胞的活化和抗菌物质的产生发挥病原清除的作用。 4、IL-17A在猪链球菌9型感染中通过下调紧密连接蛋白的转录和表达，促进病原通过血中枢神经系统屏障入脑导致脑膜炎。 IL-17A在破坏机体组织屏障系统方面具有潜在作用，并且其在猪链球菌脑膜炎中高水平表达，但是IL-17A在猪链球菌致脑膜炎中的作用还有待进一步解析。本研究利用猪链球菌9型脑膜炎菌株S29感染小鼠，发现50%的小鼠在感染48h内死亡，其余50%的小鼠在感染60h后出现明显的神经体征和脑膜炎，并逐渐死亡，且IL-17A也高水平表达。为进一步解析IL-17A在猪链球菌脑膜炎中的作用，本研究利用S29分别感染il17a?/?小鼠和野生型小鼠，发现与野生型小鼠相比，感染48h内il17a?/?小鼠的致死率和急性炎症反应无明显差异。但感染60h后，剩余il17a?/?小鼠未观察到明显的神经症状及脑膜损伤，脑中含菌量未明显升高,最终均未死亡。说明IL-17A不影响S29感染期间的急性死亡，但影响了感染后期细菌入脑以及造成的神经症状和死亡。为解析IL-17A促进病原通过血中枢神经系统屏障(Blood-CNSbarriers)入脑的机制，本研究评价了感染小鼠脑组织紧密连接蛋白(Tightjunctionproteins,TJs)的表达情况，结果显示S29感染野生型小鼠脑组织中ZO-1、Occludin和Claudin-5等TJs的转录和表达水平降低在il17a?/?小鼠中被显著抑制。说明S29感染后，IL-17A可以抑制ZO-1、Occludin和Claudin-5等TJs的转录和表达，进一步促进细菌通过Blood-CNSbarriers入脑。以上结果表明猪链球菌9型感染诱导的IL-17A通过下调TJs的转录和表达，从而有利于细菌通过Blood-CNSbarriers入脑并导致脑膜炎。 综上所述，本研究发现ST1菌株通过SLY的高表达激活NLRP3炎性小体导致细胞因子风暴和STSLS，表明获得高水平的溶血素活性是SC-19导致STSLS的关键原因。本研究表明猪链球菌2型通过激活NLRP3炎性小体，进一步通过下游的IL-18导致STSLS；而IL-17A虽然在感染中有利于细菌的清除，但在猪链球菌致STSLS中没有发挥主要作用。本研究发现IL-17A在猪链球菌9型感染中通过下调TJs的转录和表达，从而促进细菌通过Blood-CNSbarriers入脑导致脑膜炎，表明IL-17A可作为预防和治疗猪链球菌脑膜炎的潜在靶标。
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