摘要
中药配伍是中医临床用药的特色之处，通过配伍药物间产生相互作用，从而达到增效减毒的目的，且中药的传统服用方式为汤剂，中药汤剂是公认的复杂体系，其复杂性表现在由多种化学成分组成，同时又是真溶液、纳米、混悬液和乳浊液混合形成的多相体系。传统对中药的研究多针对小分子化合物，而忽略了含量较高的蛋白等大分子物质以及各成分间的相互作用。有研究报道表明，中药煎煮过程中，药物成分间可通过自组装方式结合形成超分子结构，药效作用发生变化，可能是方剂配伍增效减毒的机制之一。 芍药甘草汤源于《伤寒杂病论》，为经典名方之一，方中芍药和甘草多以1∶1进行配伍，两药合用，具有酸甘化阴，缓急止痛的效果，常用于治疗痉挛性疾病、疼痛性疾病、炎症性疾病和支气管哮喘等，关于芍药甘草汤，目前的研究多集中于小分子成分，而对多糖、蛋白等大分子成分和药物间相互作用的研究，则罕见报道，因此深入研究芍药甘草汤中蛋白等大分子成分，基于分子自组装探讨芍药甘草汤中成分间的相互作用，可阐明芍药甘草配伍后药效增强的分子机制和科学内涵，为中药的物质基础研究提供新的思路和方法。 本研究以芍药甘草汤为研究对象，提出中药在加热煎煮的过程中，汤剂中含有的大量蛋白质与小分子化合物通过自组装形成了稳定的纳米微粒，该微粒很可能是芍药和甘草配伍增效的活性成分之一。因此，本研究对芍药甘草汤的小分子和大分子类化学成分进行了分析测定，模拟了汤剂中各类成分间的自组装过程，明确了汤剂中蛋白主要归属于甘草，并从甘草中提取和分离了目的蛋白，对该蛋白的序列进行分析，并发现该蛋白与芍药苷可通过自组装形成纳米微粒，主要研究内容和结果如下： 1芍药甘草汤自组装过程的研究 对芍药甘草汤的煎煮过程进行了表征，发现汤剂在煎煮过程中，pH逐渐降低至5左右，粒径和zeta电位的绝对值逐渐变大后趋于平稳；透射电子显微镜(TEM)观察汤剂形貌，显示呈颗粒散状无规则分布，且颗粒之间容易相互粘连或聚集；使用超高效液相色谱-串联质谱仪(UPLC-MS/MS)测定7种小分子化合物的含量，显示芍药苷含量最高;通过BCA法测定蛋白类成分，显示蛋白含量为51.78mg/mL；借助苯酚-硫酸法和离子色谱电化学法测定和分析多糖组分，显示多糖含量为175.11mg/mL，其中葡萄糖含量最高(91.51mg/mL)。 采用醇沉、萃取和阴离子交换色谱从芍药甘草汤中提取和分离了小分子化合物、蛋白和多糖，并将小分子分别与多糖、蛋白组合，模拟汤剂煎煮环境进行自组装，测定组装前后小分子化合物的含量变化，结果显示除异甘草素外，小分子化合物含量均显著降低(P＜0.01)，其中芍药苷含量降低最多，而蛋白和多糖对小分子化合物的组装率则无明显差别。 通过差度离心制备芍药甘草汤中的胶体颗粒，对其中的各类化合物进行了含量测定，结果显示胶体颗粒中含有大量多糖(64.92%)和蛋白(16.20%)，以芍药苷为代表的小分子化合物含量(6.04%)最低。 2甘草蛋白的提取、分离和鉴定 使用十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)对芍药汤、甘草汤和芍药甘草汤醇沉后的蛋白进行表征，结果显示芍药甘草汤醇沉蛋白有两个条带，分子量分别为25-35KDa和63-75KDa，且62-75KDa之间的蛋白条带较明显，这两个条带均来源于甘草。通过缓冲液冷浸、醇沉、离子交换色谱和透析从甘草中分离纯化了甘草蛋白，该蛋白中63-75KDa的蛋白含量大于85%。 采用全柱成像毛细导管等电聚焦测定了甘草蛋白的等电点，结果显示甘草蛋白中主要物质等电点为：5.52、5.57、5.62；采用氨基酸自动分析仪对甘草蛋白的氨基酸组分进行了测定，结果显示天冬氨酸、丝氨酸和苯丙氨酸含量较高；通过高分辨质谱和数据库获得了甘草蛋白的氨基酸序列，结果显示该蛋白为甘草中的凝集素类蛋白。 3芍药苷-甘草蛋白自组装纳米微粒的构建和组装机制 以芍药苷结合量为评价标准，通过单因素实验考察了芍药苷浓度、甘草蛋白浓度、pH值、加热时间和加热温度5个条件，发现当芍药苷与甘草蛋白按1∶10混匀(pH=8),100℃加热40min时，芍药苷与甘草蛋白的结合量(315.64μg)最多，构建了芍药苷-甘草蛋白自组装纳米微粒； 通过丁达尔效应、激光粒度仪、扫描电子显微镜(SEM)和TEM对芍药苷-甘草蛋白自组装纳米微粒的理化性质进行了表征，发现自组装纳米微粒具有明显的丁达尔现象，粒径为148.23±0.0436nm,zeta电位为45.85±9.1550mV,SEM和TEM显示自组装纳米微粒呈球状分布；评价了芍药苷-甘草蛋白自组装微粒的稳定性，结果显示经过室温放置24h，-80℃存储15天和-20℃反复冻融3次后，自组装纳米微粒的芍药苷结合量、蛋白含量和SDS-PAGE条带均未发生明显变化； 通过紫外-可见吸收光谱(UV)、红外光谱(IR)和核磁共振氢谱(1H-NMR)对芍药苷和甘草蛋白的自组装机制进行了表征，UV结果显示芍药苷与甘草蛋白形成自组装微粒后，芍药苷在210-260nm处的特征吸收峰被消失或掩盖；IR结果显示当芍药苷与甘草蛋白形成自组装微粒后，芍药苷的羟基峰和羰基峰向低频方向移动，苯环上芳氢振动峰的峰形发生了变化，苯环骨架振动峰受结合作用的影响，发生波动或被掩盖；1H-NMR结果显示芍药苷和甘草蛋白形成自组装微粒后，芍药苷苯环上的氢质子由高场移到低场，糖部位和脂肪环部位的氢质子也有明显变化，且在低场区出现新的峰。 通过同源建模、分子对接和分子动力学计算并模拟了芍药苷和甘草蛋白的自组装机制，分子对接结果显示氢键作用(静电作用)以及疏水作用(范德华作用)是芍药苷和甘草蛋白结合的主要作用力；分子动力学结果显示芍药苷和甘草蛋白通过自组装形成的纳米微粒较为稳定，结合位点刚性较强，芍药苷和甘草蛋白的结合能为-16.88±0.95kcal/mol，结合能分解显示静电能以及范德华能为主要的贡献能，与分子对接结论一致，残基分析结果显示贡献最强的GLY-19残基可以和芍药苷形成两个氢键作用。 4芍药苷-甘草蛋白自组装纳米微粒的安全性和体外摄取 通过CCK-8和溶血实验考察了对芍药苷-甘草蛋白自组装纳米微粒的安全性，CCK-8结果显示芍药苷-甘草蛋白自组装纳米微粒对大鼠背根神经节细胞(DRG)无明显毒性，溶血结果显示甘草蛋白具有部分溶血现象，而与芍药苷形成纳米微粒后，则无溶血现象发生。 使用异硫氰酸荧光素(FITC)标记了甘草蛋白和芍药苷-甘草蛋白自组装纳米微粒，通过激光共聚焦观察二者进入A549细胞的情况，结果显示，甘草蛋白和芍药苷-甘草蛋白自组装纳米微粒均能够进入细胞，且后者进入细胞量更多。 结论 芍药甘草汤主要由小分子化合物、多糖和蛋白组成，小分子化合物中芍药苷含量最多，汤剂中含量较高的蛋白主要来源于甘草，分离纯化的甘草蛋白为凝集素类蛋白，可与芍药苷通过自组装形成稳定的纳米微粒，该微粒具有良好的安全性，并且能够进入细胞，提示甘草蛋白是芍药苷的有效载体，解释了芍药-甘草药对配伍的物质基础。
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