摘要
随着生物能源行业的蓬勃发展，在生产生物柴油的过程中将会产生越来越多价格低廉的副产物粗甘油。利用这些甘油为原料生产高附加值的产品，不仅能降低生物基产品的生产成本，而且能促进生物能源行业的发展。聚γ-谷氨酸（polyγ-glutamicacid，γ-PGA）作为一种新型生物高分子材料，在食品、医药、环保和农业等领域具有广泛应用价值。利用甘油发酵生产γ-PGA，可以实现资源合理化利用，也可降低γ-PGA的发酵成本，促进γ-PGA得到更为广泛的应用。但地衣芽胞杆菌利用甘油发酵γ-PGA存在着甘油利用率低和γ-PGA合成速率慢的缺点，限制了其工业化应用。 本研究以BacilluslicheniformisWX-02为出发菌株，通过理性代谢工程的手段对甘油代谢途径和主要中心代谢途径进行改造，以提高甘油的利用效率和NADPH可用性，从而实现高效利用甘油合成γ-PGA。 本研究对甘油呼吸型代谢途径进行了代谢工程改造，分别缺失glpFK操纵子前导区和在B.licheniformisWX-02染色体上整合甘油激酶编码基因glpK。研究发现，删除glpFK操纵子的前导区导致γ-PGA产量和菌体生物量同时降低，未达到解除tglpFK依赖的CCR机制提高甘油利用的目的。glpK整合表达菌株在以甘油为碳源且无外源谷氨酸添加的培养基中，γ-PGA产量和甘油消耗率分别比野生菌WX-02提高了32.34%和23.21%。同时发现在WX-02染色体上增加一个glpK拷贝后，不仅提高了glpK自身的转录水平，也使若干途径的关键基因的转录水平上调。 同时我们着眼于甘油代谢在DHAP（磷酸二羟丙酮）节点处的碳通量变化，对糖异生途径进行了代谢工程改造，以表达丙酮酸羧化酶、丙酮酸羧激酶、磷酸葡萄糖异构酶和果糖1,6-二磷酸酶的编码基因pycA、pckA、pgi和glpX作为候选基因，通过游离强化表达研究了这四个基因对甘油代谢和γ-PGA合成的影响。pycA、pckA和pgi分别强化表达对γ-PGA产量没有显著影响，但glpX游离强化表达菌株的γ-PGA产量比对照菌株提高了43.59%。同时通过替换glpX基因的原始启动子或者增加基因glpX的染色体拷贝来增强glpX的表达。研究发现，使用来源于Bacillussubtilis168的组成型启动子P43替换glpX基因的启动子PglpX使γ-PGA的产量和甘油利用率分别提高了26.87%和27.86%；同时，在地衣芽胞杆菌WX-02染色体上增加一个glpX拷贝后，γ-PGA产量和甘油消耗量分别提高了27.64%和26.82%，而且发现glpX及其它途径的若干基因的转录水平发生上调。 此外，我们通过在地衣芽胞杆菌WX-02染色体上分别整合葡萄糖-6-磷酸脱氢酶编码基因zwf、转酮醇酶编码基因tkt1和tkt2基因来强化磷酸戊糖途径。研究发现，其中在WX-02染色体上增加一个zwf基因拷贝使得γ-PGA产量和甘油利用率分别提高了17.11%和14.19%，整合表达基因tkt1使甘油消耗量提高了24.31%，并且γ-PGA产量也较原始菌提高了14.39%。 本研究构建了3株多基因同时整合表达工程菌EIC2、EIC3和EIC4，对甘油的代谢流重新定向，各工程菌的γ-PGA产量、生物量和甘油消耗量相比野生菌都有显著的提高，同时通过关键基因转录水平的变化揭示了关键基因的整合表达提高甘油利用和γ-PGA产量的可能原因。我们研究发现，将glpK、glpX、zwf和tkt1四个基因同时整合到WX-02染色体上而构建成工程菌EIC4的胞内NADPH相比野生菌WX-02提高了30.45%，为γ-PGA的合成提供了更多的谷氨酸前体和NADPH。
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