研究背景与目的 原发性肝癌起源于肝脏的各种病变，往往到了晚期才能发现病症。普通治疗比如化疗和放疗的效果不尽人意，近年来免疫治疗成为肝癌治疗的新途径。2020年5月第一个用于治疗肝细胞癌的一线药物免疫检查点抑制剂阿替利珠单抗通过美国FDA审批，但其分子量太大导致了给药方法的局限。研究团队前期研究发现miR-122-3p在临床肝癌组织、尤其是气虚血瘀组肝癌中显著表达降低。六君子丸是临床治疗肝癌的常用中药，具有益气健脾的功效，对症气虚血瘀型原发性肝癌。因此本论文旨在研究miR-122-3p在原发性肝癌发生中的作用，以及六君子丸是否通过miR-122-3p及相关免疫机制发挥抗肝癌作用。 方法 1.生物信息学分析临床差异表达的miR-122-3p调控的靶基因； 2.转染miR-122-3p的mimics和inhibitor至肝癌细胞中确定靶基因； 3.人肝癌细胞转录组测序探寻受UBE2I影响的下游基因； 4.生物信息学分析确定UBE2I与PD-L1在肝癌中的相关性； 5.免疫荧光实验检测过表达UBE2I肝癌细胞的PD-L1表达水平以及六君子丸提取物的干预作用； 6.流式细胞术检测JurkatT细胞在与人肝癌细胞共培养后的凋亡变化以及六君子丸提取物的干预作用； 7.荧光定量PCR实验和WesternBlot实验检测过表达UBE2I后肝癌细胞PD-L1的表达以及六君子丸提取物的干预作用； 8.WesternBlot实验分析肝癌细胞UBE2I对PD-L1调控的机制； 9.荧光定量PCR实验检测六君子丸提取物对miR-122-3p表达量的影响。 结果 1.生物信息学分析：通过查阅文献、数据库或预测获得并筛选出miR-122-3p的与肿瘤相关的靶基因，其中UBE2I符合筛选条件，且UBE2I在肝癌与癌旁组织中的表达差异有统计学意义，选取UBE2I作为靶基因研究对象； 2.转染结果显示在两种人肝癌细胞中，miR-122-3p抑制物（inhibitor）对UBE2I蛋白表达量有上调作用，而miR-122-3p模拟物（mimics）对UBE2I蛋白表达量有显著下调作用，证实UBE2I的表达受miR-122-3p调控； 3.人肝癌细胞转录组测序：与对照组相比较，UBE2I过表达组中PD-L1的转录水平上升，而miR-122-3pmimics转染组UBE2I以及PD-L1的转录水平下调，说明PD-L1可能是miR-122-3p/UBE2I的下游基因； 4.生物信息学分析结果显示，UBE2I与PD-L1在肝癌组织中的表达存在强正相关性，p值为2.74×10-9； 5.荧光定量PCR结果显示，与对照组相比较，UBE2I过表达的肝癌细胞株PD-L1的表达水平同时上调；免疫荧光实验结果显示，与对照组相比较，UBE2I过表达肝癌细胞株的PD-L1蛋白表达量均显著上调，说明UBE2I促进PD-L1蛋白表达； 6.流式细胞术结果显示，与对照组相比较，经过PHA刺激后的JurkatT细胞（刺激产生PD-1）与UBE2I过表达的肝癌细胞（产生PD-L1）共培养后，JurkatT细胞凋亡率明显上升，说明UBE2I可通过促进PD-L1表达增强肝癌的免疫抑制；7.WesternBlot实验结果表明，与对照组相比较，UBE2I过表达组的PD-L1、p65/p-p65蛋白水平上调，IκBα蛋白水平下调，说明UBE2I是通过NF-κB信号通路促进PD-L1表达； 8.荧光定量PCR结果显示，与对照组相比较，六君子丸药物组的miR-122-3p表达水平上调，UBE2I和PD-L1的mRNA水平下调，说明六君子丸提取物促进miR-122-3p表达从而下调UBE2I和PD-L1；WesternBlot实验结果显示，与对照组相比较，药物组UBE2I、PD-L1和p65/p-p65蛋白水平下调，IκBα蛋白水平上调。说明六君子丸可通过miR-122-3p/UBE2I/NF-κB抑制PD-L1表达。 9.流式细胞检测显示，经过PHA刺激后的JurkatT细胞（刺激产生PD-1）与UBE2I过表达的肝癌细胞（产生PD-L1）共培养后，与对照组相比较，六君子丸提取物可显著抑制JurkatT细胞的凋亡，并成剂量依赖性。说明六君子丸提取物可通过miR-122-3p/UBE2I/NF-κB信号传导途径抑制PD-L1表达，从而改善肝癌免疫抑制。 结论 miR-122-3p通过抑制靶基因UBE2I调控NF-κB信号通路从而下调免疫检查点PD-L1的表达，调节肿瘤微环境的抗肿瘤免疫。六君子丸提取物作用于miR-122-3p，通过UBE2I调控免疫检查点PD-L1达到增强抗肿瘤免疫的效果。
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