摘要
硬骨鱼类的牙列在脊椎动物中最具代表性，对于不同物种，牙齿在口腔中的分布、牙齿排列、牙齿数量、形状和大小方面均呈现出复杂的多样性。所有硬骨鱼都有牙齿连续替换的现象，在口腔或咽腔的牙齿过了功能期后，一颗牙齿被同一位置（位点）的新牙齿替换，这种牙齿的更替持续终生，目前关于鱼类牙齿发生的分子机制还不是很清楚。分泌型钙结合磷蛋白（SecretoryCalciumbindingPhosphoprotein，SCPP）基因家族编码多种磷酸蛋白，其中多种磷酸蛋白参与骨的骨化作用，已被报道在哺乳动物骨骼、牙釉质和牙本质的发育生成中起到了至关重要的作用。但其对鱼类牙齿发育的表达调控作用还不是很明确。本研究以水产模式动物斑马鱼为研究对象，在比较其有无牙齿鳃弓转录组基因表达差异基础上，聚焦scpp5基因，构建斑马鱼scpp5基因功能缺失的突变品系，通过各种染色和组织学观察方法比较突变品系的生长及牙齿发育情况，分析scpp5基因对于牙齿发育的调控功能；同时转录组测序比较突变体和野生型斑马鱼第五对鳃弓（有牙齿）组织的基因表达差异，明确SCPP家族基因对牙齿发育的分子调控作用。主要研究结果如下。 1.野生型斑马鱼有/无牙齿鳃弓转录组比较分析 利用转录组测序技术，对3月龄野生型斑马鱼成鱼的第四鳃弓（无牙齿）和第五鳃弓（有牙齿）组织进行转录组测序，野生型斑马鱼第五鳃弓和第四鳃弓相比，有3416个差异表达基因，其中2272个基因显示上调，1144个基因显示下调。差异基因表达分析结果显示SCPP家族关键基因ODAM、sparcl1、spp1、scpp1、scpp5、scpp6、scpp7、scpp8和scpp9中，除sparcl1基因外，其余8个基因第五鳃弓中的表达量均显著高于第四鳃弓（P＜0.05）。野生型第五鳃弓和第四鳃弓组织的差异表达基因通路富集分析显示细胞因子-细胞因子受体相互作用通路、吞噬体通路、TGF-β信号通路、ECM-受体相互作用通路、钙信号通路等信号通路在斑马鱼牙齿发育中发挥着重要作用。 2.scpp5基因敲除品系斑马鱼的构建和表型分析 通过CRISPR/Cas9基因编辑技术，构建了scpp5基因敲除斑马鱼品系，scpp5第一外显子缺失16bp的突变品系使得氨基酸编码终止提前。对野生型和scpp5突变品系90dpf成鱼进行茜素红骨骼染色观察，结果显示scpp5的骨骼表型与野生型基本没有显著性差异，脊椎骨、肋骨、头骨以及肌间骨都属于正常矿化生长，肋骨、肌间骨的数量也没有明显差异，但突变品系牙齿较野生存在明显缺失。野生型斑马鱼牙齿通常分为三层，分布于背侧、中侧和腹侧，排列式为5-4-2，而scpp5基因突变品系牙齿排列较野生型相比不是特别固定，90dpf后的成年突变体大多呈现为2-2-2的排布。进而观察了突变品系10dpf到90dpf的牙齿发育情况，结果显示突变品系20dpf开始就发生了牙齿的缺失，到30dpf这一现象变的逐渐明显，直到90dpf能很明显的观察到牙齿的缺失现象。 3.scpp5基因对斑马鱼牙齿发育的分子调控机制初探 对3月龄scpp5基因敲除品系斑马鱼成鱼的第四和第五鳃弓组织进行转录组测序分析，scpp5纯合子第四对鳃弓和野生型第四对鳃弓相比，共有2365个差异表达的基因，在这些基因中有877个基因为显著上调基因，有1488个基因为显著下调基因。纯合子第五对鳃弓和纯合子第四对鳃弓相比，共有6263个差异表达基因，在这些基因中有3376个基因为显著上调基因，有2887个基因为显著下调基因。纯合子第五对鳃弓和野生型第五对鳃弓相比，共有1255个差异表达基因，在这些基因中645个基因为显著上调基因，有610个基因为显著下调基因。scpp5基因突变品系和野生型第五鳃弓的差异表达基因主要集中在细胞因子-细胞因子受体相互作用通路、脂肪细胞因子信号通路、氨基酸的生物合成通路、单纯疱疹感染通路、精氨酸生物合成通路、半胱氨酸和蛋氨酸代谢通路等信号通路。采用qRT-PCR方法分析ODAM、sparcl1、fa93e10、spp1、scpp1、scpp5、scpp6、scpp7、scpp8和scpp9在野生型和突变品系第四和第五鳃弓中的表达情况，结果显示除sparcl1基因外，9个基因在scpp5基因突变纯合体中的表达量均低于野生型（P＜0.05）。
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