摘要
禾谷镰刀菌能够侵染小麦、玉米、水稻、大豆等多种农作物而使其产生病害，不仅造成了粮食和饲料的大量减产，并通过毒素污染对人类和家畜健康造成严重危害，导致我国粮食和饲料原料资源短缺问题进一步加剧，严重威胁着我国粮食和饲料安全。从粮食和饲料生产的源头控制禾谷镰刀菌毒素污染，是预防禾谷镰刀菌毒素危害最有效的方法。田间传统化学农药的施用，尽管已证明具有一定的预防效果，但易造成土壤污染、农药残留、产生抗性菌株及其对非靶标生物的危害等一系列负面影响，严重制约着国家青山绿水的建设。植物源性提取物具有安全、无公害等多重优点，并具有广泛的抑菌作用，已成为当前研究的热点。百里香酚作为植物源性化合物，在饲料和养殖行业得到了广泛的应用，但是否可有效抑制禾谷镰刀菌的生长和产毒，相关研究十分有限，其作用机制未见报道。本文研究了百里香酚、枯茗醛和桉叶油3种植物提取物及12种常用的抑菌剂对禾谷镰刀菌的抑制作用，结果表明，百里香酚对禾谷镰刀菌展现出了良好的抑制效果，在此基础上，本文进一步研究了百里香酚在抑制禾谷镰刀菌菌丝生长、孢子萌发、毒素产生、生理生化变化等方面的作用规律，通过转录组学研究了其抑制禾谷镰刀菌生长和产毒的分子机制，为百里香酚的开发利用提供了理论依据，并可为同类植物提取物的研发利用以及从源头控制饲料霉菌毒素污染问题提供借鉴。主要研究如下： 第一部分禾谷镰刀菌高效抑制剂的筛选 选用3种植物源性物质（枯茗醛、桉叶油、百里香酚）与12种抑菌剂（戊唑醇、吡唑醚菌酯、苯醚甲环唑、代森锰锌、丙森锌、草甘磷异丙胺盐、啶虫脒、吡虫啉、辛硫磷、阿维菌素、伊维菌素、多拉菌素）为试验材料，通过马铃薯葡萄糖琼脂（PDA）培养法考察他们对禾谷镰刀菌的抑制效应。将培养基于25℃下连续培养4d后，通过十字交叉法测量菌落的生长直径，计算抑制率，并建立毒力回归方程，求导EC50值。主要结果如下： 1、15种化合物都能够抑制禾谷镰刀菌的生长，但呈现出不同的剂量效应关系。 2、百里香酚对禾谷镰刀菌的抑制效果优于枯茗醛、桉叶油，也优于大多数传统抑菌剂，在其含量达到200μg/mL时可完全抑制禾谷镰刀菌的生长。 结果表明，百里香酚对禾谷镰刀菌具有良好的抑制作用，作为植物源性物质，具有较好的研究价值和应用前景。 第二部分百里香酚对禾谷镰刀菌菌丝生长和分生孢子萌发的影响 根据第一部分结果，本部分进一步研究了百里香酚影响禾谷镰刀菌菌丝生长和分生孢子萌发的作用规律。以不同浓度的百里香酚处理禾谷镰刀菌，分别在PDA培养基上观察菌丝生长并测量培养1-4d的菌落直径大小，计算抑制率；在马铃薯葡萄糖水（PDB）培养基中观察不同培养时间点分生孢子的萌发数量，统计萌发率。针对分生孢子在百里香酚160μg/mL浓度下培养72h仍不萌发的情况，延长了该浓度下培养时间至120h，并在96h和120h时进行检查，以检验此浓度下百里香酚可否发挥更长时间的抑菌效应。主要结果如下： 1、百里香酚能够有效抑制禾谷镰刀菌菌丝的生长，具有明显的剂量效应关系，其EC10、EC50、EC90分别为11.59μg/mL、40.15μg/mL、139.12μg/mL。当浓度达到160μg/mL时，可完全抑制禾谷镰刀菌菌丝的生长。 2、百里香酚能够有效抑制禾谷镰刀菌分生孢子的萌发，存在明显的剂量反应关系，其EC10、EC50、EC90分别为19.22μg/mL、36.19μg/mL、76.47μg/mL。当浓度达到160μg/mL时，可完全抑制孢子的萌发。 结果表明，百里香酚对禾谷镰刀菌菌丝生长和分生孢子萌发具有显著抑制作用，当浓度达到160μg/mL时，可完全抑制菌丝的生长和分生孢子的萌发。 第三部分百里香酚对禾谷镰刀菌呕吐毒素和麦角甾醇合成及生理生化指标的影响 分别按EC50和EC90设置百里香酚在葡萄糖酵母提取物蛋白胨（GYEP）培养基中的浓度，25℃下对禾谷镰刀菌进行培养，7d后，通过LC-MS法测定培养液中脱氧雪腐镰刀菌烯醇（DON）、3乙酰脱氧雪腐镰刀菌烯醇（3ADON）、15乙酰脱氧雪腐镰刀菌烯醇（15ADON）的含量。在GYEP培养基中，分别添加成含有20、40、80μg/mL浓度的百里香酚，对禾谷镰刀菌进行培养，7d后，通过HPLC法测定菌体麦角甾醇的含量。另分别用20μg/mL、40μg/mL、80μg/mL浓度的百里香酚对禾谷镰刀菌处理一段时间，分别测定菌丝的pH值和电导率。 主要结果如下： 1、百里香酚能够显著抑制禾谷镰刀菌毒素的合成（P＜0.05），其中EC50浓度下分别使DON、3ADON、15ADON含量降低了85.60%、76.58%、76.66%；EC90浓度下分别使DON、3ADON、15ADON含量降低了87.67%、84.76%、85.56%。 2、百里香酚可以抑制禾谷镰刀菌麦角甾醇的合成，在20、40、80μg/mL浓度下分别使麦角甾醇的含量降低了13.09%、27.29%、39.98%。 3、百里香酚可以破坏禾谷镰刀菌细胞膜的稳定性，使菌体pH降低，电导率升高。 结果表明，百里香酚能够有效抑制禾谷镰刀菌对DON及其衍生物和麦角甾醇的合成，其中对DON合成的抑制效应强于对麦角甾醇合成的抑制效应，并可破坏菌体细胞膜，阻碍菌体的生长和代谢。 第四部分百里香酚抑制禾谷镰刀菌生长和呕吐毒素产生的作用机制研究 使用与EC50对应浓度的百里香酚，对GYEP中培养的禾谷镰刀菌进行48h的处理，收集菌丝并对其进行了转录组学分析和生物学信息分析。主要结果如下： 1、百里香酚可显著下调禾谷镰刀菌的主要产毒基因的表达（P＜0.001），并可使麦角甾醇合成基因ERG5、ERG6和ERG24表达显著下调（P＜0.001）。 2、百里香酚对禾谷镰刀菌在基因转录水平上的影响，体现在差异表达基因主要分布于氨酰tRNA的合成、糖酵解的代谢、丙酮酸的代谢、菌体生长、次级代谢产物、麦角甾醇的合成、DON的合成和信号转导过程。 3、百里香酚对禾谷镰刀菌的影响主要与氨酰tRNA合成、糖酵解、丙酮酸代谢、MAPK信号转导、细胞周期等5条通路相关，在这5条通路中，与百里香酚抑制禾谷镰刀菌的生长和产毒作用关系最为密切的显著差异表达基因为天冬氨酸tRNA基因（AspRS）和精氨酸tRNA基因（ArgRS），丙酮酸激酶基因（KPYM）和乙酰激酶基因（ACKA），磷酸甘油酸变位酶基因（PGAM）和乙醇脱氢酶Ⅱ基因（ADH2)，肿瘤抑制基因（APC8）和细胞周期蛋白基因（CDC53），磷脂酶基因（PLCD）和钙调蛋白基因（CALM）。 结果表明，百里香酚对禾谷镰刀菌基因的表达具有广泛的影响，主要通过5条通路及通路中的显著差异表达基因抑制禾谷镰刀菌的生长和产毒。 综上所述，得出主要结论如下： 1、百里香酚能够显著抑制禾谷镰刀菌的菌丝生长、分生孢子萌发、麦角甾醇的生物合成和DON及其乙酰化衍生物的生物合成。 2、百里香酚可以改变禾谷镰刀菌菌体细胞膜的通透性，使菌体内容物发生渗漏，对禾谷镰刀菌造成损伤，从而抑制了禾谷镰刀菌的生长和产毒。 3、百里香酚对禾谷镰刀菌基因表达具有广泛的影响，并主要通过调控5条通路及通路中的关键基因抑制其生长和产毒。
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