摘要
茄科雷尔氏菌（Ralstoniasolanacearum）引起的植物细菌性青枯病是一种世界范围内广泛分布的毁灭性病害，其寄主范围广，可侵染50多个科的400多种植物，病害发生后导致整株植物枯萎死亡，防治非常困难，被称为植物的“癌症”。在我国番茄、马铃薯和烟草等茄科作物青枯病危害十分严重，生产上缺乏可以被广泛利用的抗病基因。安全防控茄科青枯病亟需新型的防治策略和抗病育种基因资源。病原相关分子模式（PAMPs）被植物细胞膜的模式识别受体（PRRs）识别激活寄主第一层次的先天免疫反应（PTI），提供广谱稳定持久的基础抗性。目前番茄对茄青枯菌的识别机制认知有限，本研究的目标是分离鉴定青枯菌中潜在的病原相关分子模式，并分析该免疫反应在抗青枯病过程中的作用，期望指导培育相对稳定持久的抗病品种，帮助解决生产中番茄青枯病的问题。 本研究发现青枯菌GMI1000分泌总蛋白可以激活番茄根部典型的PTI免疫反应，包括诱导胞外碱化、触发ROS爆发、激活MAPKs反应以及诱导免疫相关基因上调表达和胼胝质的积累等；经过进一步分段筛选和LC-MS/MS质谱鉴定，青枯菌的果胶外切酶PehC在蛋白质谱中丰度最高；我们构建了pGST-PehC原核表达载体并纯化融合蛋白，发现GST-PehC处理番茄根部后可以触发典型的PTI免疫反应，同时发现PehC触发多种茄科植物PTI免疫反应而且具有根部特异性，但是不能触发茄科植物叶片的免疫反应，PehC触发茄科植物免疫反应依赖于N端序列且与酶学催化活性没有关系；RNA-seq转录组分析发现番茄根部在PehC处理1h后大量抗病和信号转导相关基因上调表达。因此研究确定了PehC是青枯菌中激活番茄根部PTI免疫反应的新型PAMP。 青枯菌基因组编码三种果胶水解酶，我们的实验结果表明果胶内切酶PehA和另一种果胶外切酶PehB均不具有激发番茄免疫反应的活性。系统进化分析发现PehA同源的多聚半乳糖醛酸内切酶广泛分布于植物病原细菌中，而与PehB和PehC同源的多聚半乳糖醛酸外切酶仅存在茄科雷尔氏菌相近的属中，在其它病原细菌则比较少见。PehC单敲除菌株的分泌蛋白相比野生菌株显著丧失了诱导番茄免疫的能力，但是突变体对番茄的致病力有轻微下降而且能够明显降低青枯菌在番茄木质部的定殖，暗示PehC在青枯菌侵染中有多种功能。研究结果表明，PehC作为果胶外切酶可以将PehA降解果胶产生的多聚半乳糖醛酸（OGs）进一步水解成半乳糖醛酸GalA单体；一方面青枯菌可以在GalA为唯一碳源的基本培养基中生长，野生型青枯菌侵染番茄后能够提高木质部中还原糖的浓度供其生长，但是?pehc突变体侵染后则不能有效产生还原糖，该结果可以解释?pehc突变体在植物中定殖能力下降。另一方面，由青枯菌PehA降解细胞壁果胶产生的OGs是一种重要的损伤相关因子（DAMP），可以激活番茄的免疫反应如ROS爆发和胞外碱化等，该DAMP经过PehC进一步水解成GalA单体后丧失了激活免疫反应的能力，表明PehC可以帮助青枯菌逃避OGs引起的番茄免疫反应。 为了明确PehC触发的番茄免疫反应在抗青枯病中的作用，将纯化的PehC蛋白预处理番茄幼苗和或灌根处理成株的根部后接种青枯菌，发现与对照组相比青枯菌在处理组番茄幼苗根部和成株茎部中的定殖量均显著降低，而且预处理组番茄的青枯病发病率和病情指数显著降低，同时存活率会显著升高；进一步通过农杆菌介导的番茄外植体转化构建了稳定表达PehC蛋白的番茄转基因株系，接种青枯菌GMI1000后发现转基因株系的青枯病发病率、病情指数相比对照Moneymaker植物有明显降低，存活率也有所提高，说明转基因表达PehC的番茄对青枯菌的抗性有所增强。同时研究结果显示PehC转基因番茄的种子萌发、幼苗根长和鲜重，以及成株的生长状态和野生型植物没有显著差异，暗示了青枯菌PehC蛋白可以作为一种潜在的免疫诱抗剂提高番茄对青枯菌的抗性。 综上所述，本论文研究表明青枯菌的分泌蛋白PehC是一种能被茄科植物识别的新型PAMP分子，该蛋白在青枯菌和植物互作中发挥多重功能，既可以帮助青枯菌在木质部中获得碳源营养，又可以帮助青枯菌躲避DAMP引起的植物免疫反应，然而番茄在进化中获得了识别PehC引发免疫的能力，体现了病原菌和寄主植物的共进化。
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