摘要
随着日趋激烈的社会竞争和人们生活节奏的加快，不良生活方式的人群越来越多，诸如饮食不规律、缺乏运动、睡眠不足和经常性的熬夜加班，导致越来越多的人倍感疲劳。据报道，全球约有10%的普通人群多频次经历六个月或更长时间的过度劳累，健康状况受损。疲劳是一种常见的生理现象，当精神或体力消耗到一定程度时，就会产生疲劳。它意味着机体工作能力的短暂下降，不仅使人身心俱疲，而且还会造成免疫力低下，甚至处于疾病或“亚健康”状态。研究表明，能量耗尽、氧化应激反应和代谢物堆积等是造成疲劳的主要原因。高F值肽是指由2~20个氨基酸组成，且F值大于20的生物活性肽，具有特殊的氨基酸组成和缓解疲劳的潜在作用，是近年来功能食品领域的研究热点。因此，本研究以新鲜山羊乳为原料，优化高F值肽的酶解制备工艺，采用超滤和凝胶过滤层析分离纯化目标活性肽，分析鉴定羊乳高F值肽的氨基酸组成和肽段序列，并通过动物试验进行抗疲劳功效评价，确定羊乳高F值肽的功效特性，以期为羊乳的高值化利用提供技术支撑。本研究主要结果如下： （1）确定了羊乳高F值肽的双酶酶解最佳工艺条件。采用双酶分步水解、活性炭静态吸附脱芳制备羊乳高F值肽，以蛋白质水解度和F值为指标，通过单因素和响应面分析法确定了最佳内肽酶为碱性蛋白酶，最佳工艺条件为：加酶量4000U/g、底物浓度6%、酶解pH9.0、温度45℃、时间3h；最佳外肽酶为风味蛋白酶，最佳工艺条件为：加酶量6200U/g、酶解pH6.5、温度49℃、时间2h。制备得到的羊乳高F值肽F值为21.82，达到高F值（F＞20）的技术要求。 （2）对羊乳高F值肽粗品进行分离纯化和序列鉴定。采用超滤、凝胶层析过滤两级分离技术，得到目标高F值肽，其分子量在612-1355Da之间，F值为27.81，较纯化前提高了27.47%。通过液质联用技术共鉴定出了5个肽段，其序列结构分别是GACLLPK(Gly-Ala-Cys-Leu-Leu-Pro-Ly)、LGVRGGGG（Leu-Gly-Val-Arg-Gly-Gly-Gly-Gly）、SIAPEY（Ser-Ile-Ala-Pro-Glu-Tyr）、INGAPKN（Ile-Asn-Gly-Ala-Pro-Lys-Asn）和NREKPYE（Asn-Arg-Glu-Lys-Pro-Tyr-Glu），对应分子量为758.422Da、672.439Da、679.387Da、713.463Da和935.540Da。 （3）对羊乳高F值肽进行抗疲劳功能研究。通过小鼠游泳模型评价了羊乳高F值肽的抗疲劳功效及其抗疲劳机制，发现灌胃羊乳高F值肽对小鼠的正常生长发育和肝脏无显著影响（P＞0.05），且能显著延长（P＜0.05）小鼠负重游泳时间，并减少运动后体内代谢产物血乳酸、血尿素氮和血氨的积累，增加肝糖原和肌糖原的储备，减少肌肉细胞中肌酸激酶和乳酸脱氢酶外渗，增加肌肉组织的超氧化物歧化酶和谷胱甘肽过氧化物酶活性，同时降低了丙二醛含量，增加了肌肉组织的ATP含量、Na+-K+—ATP酶和Ca2+-Mg2+—ATP酶水平。显现出羊乳高F值肽可有效保护细胞免受氧化应激损伤，促进能量代谢相关酶的合成，增加肌肉收缩中的能量补充。同时，皮尔逊分析显示，小鼠体内的氧化应激、能量代谢与疲劳水平密切相关，表明羊乳高F值肽可能是通过抑制氧化应激和增强线粒体能量代谢的作用机制发挥抗疲劳作用。 综上，双酶水解法制备羊乳高F值肽工艺可行，所得高F值肽具有明显的缓解疲劳作用，可用于羊乳基质抗疲劳产品开发。
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