摘要
沙门氏菌（Salmonella）是一种常见的的革兰氏阴性肠杆菌，广泛存在于肉、蛋、奶等动物性食品中，可引起人畜共患病或食物中毒。每年因沙门氏菌而引起的食物中毒事件在世界范围内位居首位，对公众的生命健康造成了严重的威胁。因此，建立一种沙门氏菌的快速检测方法对预防沙门氏菌的污染与传播具有重要意义。目前沙门氏菌的检测方法包括传统检测方法、分子生物学检测方法、免疫学检测方法和生物传感器技术等，相比与其他三种方法，免疫学检测方法灵敏度高、特异性强、成本低，可以用于大规模样本的快速检测。高质量的抗体是免疫学检测的关键，传统抗体存在生产周期长、操作复杂、生产成本高等问题。纳米抗体（Nanobody,Nb）因其分子量小，生产成本低，具有良好的热稳定性等优势在食品安全检测方面得到了广泛的应用。 本研究通过四轮生物淘选得到了五种沙门氏菌特异性纳米抗体，并将免疫磁分离技术（Immunomagneticseparation,IMS）和ELISA检测方法相结合，建立了一种快速简单、特异性强、灵敏度高的肠炎沙门氏菌IMS-ELISA方法，为食品中肠炎沙门氏菌的检测提供了一条新思路。本论文的研究内容及结果如下： 1.针对O抗原和H抗原的纳米抗体淘选及其性能分析：分别以肠炎沙门氏菌的O抗原（脂多糖）和H抗原（鞭毛蛋白）为目标物，对已构建的噬菌体展示纳米抗体文库进行生物淘选，得到了五种不同序列的纳米抗体，其中纳米抗体Nb-F5、Nb-F6、Nb-F14、Nb-F18可以特异性识别肠炎沙门氏菌的H抗原，Nb-F23可以同时识别O抗原与H抗原。提取五种纳米抗体的质粒并将其转化到E.coilTop10F’中进行表达，得到五种具有较高纯度的纳米抗体。通过间接ELISA对其特异性和热稳定性进行分析，除Nb-F23可以识别沙门氏菌属外，其他四种纳米抗体均对肠炎沙门氏菌表现出良好的特异性，并且五种纳米抗体均具有良好的热稳定性。 2.IMS-ELISA方法的建立及其性能分析：首先制备了基于纳米抗体的免疫磁珠IMBs，优化免疫磁珠捕获过程并应用于菌液中肠炎沙门氏菌的捕获，确定了试验的最佳条件为用0.5mg的磁珠偶联100μg纳米抗体Nb-F18，将其添加到1mL肠炎沙门氏菌菌液中孵育45min后，然后放置在磁分离架上磁分离5min。在此基础上，构建了双纳米抗体夹心ELISA方法，分别对捕获抗体和检测抗体的浓度进行优化，确定捕获抗体的最佳工作浓度为10μg/mL，检测抗体的最佳工作浓度为7.2×1010pfu/mL，该方法的检测限（LimitofDetection,LOD）为7.3×103cfu/mL。将磁富集后的肠炎沙门氏菌洗脱下来进行双纳米抗体夹心ELISA检测，并将其应用于食品样品的检测中，结果表明，经4h的预富集，该方法可检出少于10cfu/mL的肠炎沙门氏菌，比未经磁富集的方法检测灵敏度提高了约3倍，培养时间缩短了2h。
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