摘要
白细胞介素-6（IL-6）作为一种多效性细胞因子，在非特异性免疫反应中发挥着重要作用。一般认为，IL-6和膜上IL-6受体（mIL-6R）结合开启IL-6经典信号传递过程，IL-6和可溶性IL-6受体（sIL-6R）结合开启反式信号传递过程。哺乳动物中的研究表明，IL-6结合IL-6R和糖蛋白（gp130）后，激活JAK激酶/信号转导和转录激活因子3（JAK/STAT3）通路，从而调控下游基因的表达。然而，在硬骨鱼中IL-6的功能研究，特别是IL-6通过JAK/STAT3通路在非特异性免疫反应中的调控机制仍不清楚。团头鲂（Megalobramaamblycephala）是我国大宗淡水鱼类之一，由于养殖密度大、种质退化、养殖水环境污染等，导致各种由病原菌引起的病害频发，其中以嗜水气单胞菌（Aeronmonashydrophila）导致的细菌性败血症最为严重。已证实IL-6在硬骨鱼抵御病原菌中发挥重要作用，因此本论文以团头鲂为研究对象，采用生物信息学分析、荧光定量PCR（qPCR）、westernblot、抑制剂处理、转录组测序等技术手段，首先筛选IL-6下游关键信号通路，随之分析IL-6/JAK/STAT3通路的激活或抑制对免疫、铁代谢基因表达的影响以及探究IL-6对不同maSTAT3亚型的激活差异性，旨在阐明IL-6经JAK/STAT3通路在非特异性免疫应答中的调控作用，为鱼类抗病育种以及病害防治提供理论基础。主要研究结果如下： 1团头鲂IL-6经典信号和反式信号对下游信号通路和基因的调控 本研究通过qPCR检测发现，在LPS刺激团头鲂头肾淋巴细胞后，il-6mRNA水平显著上调，表明团头鲂IL-6参与免疫应答。分析发现基于原核表达系统诱导产生的团头鲂重组IL-6蛋白（rmaIL-6）和重组可溶性IL-6R蛋白（rmasIL-6R），可诱导草鱼肝脏细胞（L8824）中免疫相关基因（il-1β、il-6和socs3a）表达和STAT3磷酸化，这表明其具有生物学活性。随后，rmaIL-6和rmasIL-6R单独或联合处理L8824细胞，westernblot检测发现rmaIL-6可显著上调STAT3和ERK1/2磷酸化，而rmaIL-6联合rmasIL-6R（rmaIL-6+rmasIL-6R）只诱导STAT3磷酸化，但相较于rmaIL-6，作用效果更强烈。因此，团头鲂IL-6经典信号和反式信号主要通过激活JAK/STAT3通路而非MEK/ERK通路发挥作用。采用STAT3抑制剂（c188-9）和rmaIL-6+rmasIL-6R分别或同时刺激L8824细胞后，进行转录组测序分析，探究团头鲂IL-6反式信号经JAK/STAT3通路在非特异性免疫反应中的调控作用。GO和KEGG富集分析表明rmaIL-6介导的反式信号主要参与应激和炎症反应，STAT3的激活主要与细胞增殖、凋亡和免疫调节有关。采用qPCR检测发现，c188-9可显著抑制由rmaIL-6+rmasIL-6R诱导的免疫相关基因（cebpd、fra2、mrp1、rsk2a、sash3、socs3a和upar）的上调趋势。此外，JAK2抑制剂（TG101348）同样可以抑制上述免疫相关基因的表达。这些结果表明，IL-6介导的反式信号通过JAK2/STAT3通路诱导免疫相关基因的表达，进而参与鱼类非特异性免疫调控。 2团头鲂IL-6通过JAK/STAT3通路对铁代谢基因的调控作用 炎症、免疫反应与铁稳态密切相关。为了探究团头鲂IL-6是否参与调控铁代谢过程，本研究用rmaIL-6或rmaIL-6+rmasIL-6R刺激团头鲂原代肝细胞，发现铁代谢相关基因（ferritinH亚基，fth；transferrinreceptor，tfr；hepcidin，hepc和ferroportin1，fpn1）以及STAT3磷酸化水平均显著上调。这表明，团头鲂IL-6调控铁代谢相关基因的表达以及激活JAK/STAT3通路。通过抑制剂c188-9和TG101348处理团头鲂肝细胞，检测STAT3磷酸化和fth、tf、hepc和fpn1基因表达情况，进一步分析JAK/STAT3通路在其中发挥的作用。实验结果显示，c188-9和TG101348均可显著抑制由rmaIL-6和rmaIL-6+rmasIL-6R诱导的STAT3磷酸化及fth、tf和hepc基因上调表达。这表明，团头鲂IL-6经典信号和反式信号通过JAK/STAT3通路诱导铁代谢基因表达，从而参与铁代谢过程。 3团头鲂4种STAT3亚型表达及被IL-6经典信号和反式信号激活差异性分析 STAT3作为JAK/STAT3通路中重要成员，已在多种硬骨鱼中克隆并鉴定，但对其功能的研究还很有限。本研究通过序列比对以及qPCR验证，从团头鲂中鉴定出4种STAT3亚型（maSTAT3α1、maSTAT3α2、maSTAT3β1和maSTAT3β2），序列分析表明4种maSTAT3亚型是由同一基因剪接产生的，且氨基酸序列在硬骨鱼中相似度极高。采用qPCR检测发现，4种mastat3亚型在健康团头鲂肝脏、脾脏、头肾等10个组织中广泛表达，但表达模式存在差异性。在嗜水气单胞菌感染后，mastat3α1、mastat3α2和mastat3β2在肝脏、中肾中表达趋势相似，均可在短时间内显著上调表达；然而mastat3β1仅在肝脏中可被显著诱导上调表达，在中肾和头肾中被显著抑制表达。进一步通过rmaIL-6或rmaIL-6+rmasIL-6R刺激转染maSTAT3α1、maSTAT3α2、maSTAT3β1和maSTAT3β2的EPC细胞，探究4种maSTAT3亚型在IL-6/JAK/STAT3通路中激活差异性。结果表明，4种maSTAT3亚型均可被rmaIL-6+rmasIL-6R诱导磷酸化，但诱导趋势存在差异性；而只有maSTAT3α1和maSTAT3α2可被rmaIL-6诱导磷酸化，这表明4种maSTAT3亚型在响应IL-6的刺激中存在一定的差异性，且maSTAT3α1和maSTAT3α2可能作为IL-6主要功能执行者。总之，4种maSTAT3亚型在应对病原菌侵袭及IL-6刺激中，其功能即存在重叠性也存在差异性，这可能有利于鱼类在病原菌侵袭中存活。
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