摘要
罗布麻（Apocynum venetum L.）为夹竹桃科罗布麻属的一种耐旱、耐盐碱的经济植物。据《本草纲目》记载，罗布麻具有平肝安神，清热利水等功效。药理学研究证明，罗布麻中含有黄酮、多酚和强心苷等药用成分。罗布麻苷作为一种强心苷类化合物不仅具有强心功能，还具有降压、抗辐射、延缓衰老、抗癌和抗肿瘤等功效，但其在罗布麻中的部位和年份累积规律及其生物合成机制还未明确。因此，本研究以罗布麻为试材，在优化罗布麻苷提取和检测条件的基础上，分析了罗布麻苷在不同部位和年份的累积效应；同时，基于罗布麻转录组数据筛选罗布麻苷生物合成中的Av5βPOR和Av3βHSD家族基因，探究Av3βHSD2基因在罗布麻苷合成中的作用，为罗布麻新种质的培育奠定基础。主要结果如下： 1. 比色体系以罗布麻苷为对照品，2%3,5二硝基苯甲酸碱性溶液为显色试剂，显色反应在10 min之内稳定，对照品回收率为99.10±1.81%，精密度、重复性和回收率的相对标准偏差（RSD）均小于2%；在考察范围内，提取试剂为95%乙醇、料液比1：10、提取时间为30 min时，罗布麻苷提取效果最好，其含量可达639.34 mg/g。 2. 罗布麻苷在3、7、10年生罗布麻根、茎和叶中的含量不同，其中叶片中的含量均高于茎和根，且在7年生的叶片中含量最高，达914.86 mg/g；同时发现，根部罗布麻苷累积量在不同年份间差异不显著；对比分析罗布麻毛状根在1/2MS、MS、B5和WPM （总氮浓度分别为：30.03、60.06、31.73、10.00 mM ） （ NO3-：NH4+依次为：1.91、1.91、14.64、1.00）培养基条件下的罗布麻苷累积量，发现B5培养基条件下的罗布麻苷含量最高，达662.58 mg/g；将3 g/L KNO3添加到低氮WPM培养基中促进了罗布麻苷的累积，比WPM基础培养基条件下的罗布麻苷累积量增加了80%。由此可见，罗布麻苷的累积与组织部位，年份和氮素浓度相关。 3. 基于罗布麻转录组数据，鉴定了罗布麻孕酮5β还原酶（Av5βPOR）和罗布麻3β-羟基类固醇脱氢脱羧酶（ Av3βHSD ）家族基因。在80~160μmol/L CdCl2和200~400 mmol/L NaCl处理罗布麻4 d后发现，两个家族基因的表达水平在罗布麻不同组织部位中存在显著差异。在0.5~5 mM水杨酸（SA）、0.5~1 mM茉莉酸甲酯（MeJA）和1~5 mM硝普钠（SNP）处理愈伤组织3~24 h后发现属于同一家族的两个基因在相同胁迫下表达“步调”并不一致。通过对萌发1~14 d的罗布麻种子进行家族基因表达分析，发现Av3βHSD2基因表达量变化最为明显，在种子萌发7 d时显著升高。 4. 采用PCR方法克隆了Av3βHSD2基因，其长度为1443 bp。在优化罗布麻愈伤组织原生质体制备和瞬时遗传转化的基础上，将Av3βHSD2蛋白定位在细胞膜上。通过农杆菌介导法分别获得了Av3βHSD2基因过表达和沉默的转基因罗布麻愈伤组织，其中L3过表达株系的罗布麻苷含量最高，是对照组的2.3倍；L6沉默株系的罗布麻苷含量最低，是对照组的28%。由此可见，Av3βHSD2基因参与了罗布麻苷的生物合成。
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