摘要
目的:1.以健康SD大鼠为研究对象，研究了哥王“汗渍法”炮制后降低对大鼠的肝脏毒性。 2.Cocktail探针药物法和蛋白免疫印迹法相结合，基于细胞色素P450酶，阐明了哥王经“汗渍法”炮制后降低对大鼠肝脏毒性的机制。 方法:1.42只雄性SD大鼠随机分为生品高剂量组、生品中剂量组、生品低剂量组、炮制品高剂量组、炮制品中剂量组、炮制品低剂量组、空白组，于给药15天后，麻醉，取血，测定大鼠血清中ALP、AST、ALT酶活力的变化;取肝脏HE染色，观察各组肝脏组织形态的变化。 2.42只雄性SD大鼠随机分为生品高剂量组、生品中剂量组、生品低剂量组、炮制品高剂量组、炮制品中剂量组、炮制品低剂量组、空白组，于给药15天后，取完整肝脏。采用蛋白免疫印迹法测定“汗渍法”炮制前后了哥王对大鼠肝脏中CYP1A2、CYP3A4、CYP2C9、CYP2D6、CYP2E1、CYP2C19蛋白表达水平的影响。 3.建立孵育体系中1-羟基咪达唑仑、4-羟基甲苯磺丁脲、去甲右美沙芬、4-羟基美芬妥英、6-羟基氯唑沙宗、对乙酰氨基酚6种代谢产物UPLC-MS/MS定量分析方法。 4.42只雄性SD大鼠随机分为生品高剂量组、生品中剂量组、生品低剂量组、炮制品高剂量组、炮制品中剂量组、炮制品低剂量组、空白组，于给药15天后，取肝脏制备肝微粒体。建立肝微粒体体外孵育体系，确定最佳孵育时间和最佳蛋白浓度。采用Cocktail探针药物法测定“汗渍法”炮制前后对了哥王对大鼠肝脏中CYP1A2、CYP3A4、CYP2C9、CYP2D6、CYP2E1、CYP2C19酶活性的影响。 结果:1.与空白组相比较，生品高、中、低剂量组ALP酶活力显著升高(P＜0.01)，与炮制品高、中、低剂量组无统计学差异;生品高、中剂量组AST、ALT酶活力显著升高(P＜0.01)，与生品低剂量组、炮制品高、中、低剂量组无统计学差异。与生品高剂量组相比较，炮制品高、中、低剂量组ALP、AST、ALT酶活力显著降低(P＜0.05或P＜0.01)，与生品中剂量组ALP、ALT酶活性无统计学差异。 2.与空白组相比较，生品高、中剂量组CYP3A4、CYP1A2、CYP2C9、CYP2C19蛋白表达水平显著升高（P＜0.05或P＜0.01），生品中、低剂量组和炮制品高、中剂量组CYP2D6蛋白表达水平显著升高（P＜0.05或P＜0.01），生品高、中剂量组和炮制品高剂量组CYP2E1蛋白表达水平显著升高（P＜0.05或P＜0.01）。与生品高剂量组相比较，炮制品高、中、低剂量组CYP3A4、CYP1A2、CYP2C19蛋白表达水平显著降低（P＜0.05或P＜0.01），炮制品高剂量组CYP2D6蛋白表达水平显著升高(P＜0.05)，炮制品中、低剂量组CYP2E1蛋白表达水平显著降低(P＜0.01)，炮制品低剂量组CYP2C9蛋白表达水平显著降低(P＜0.05)。 3.从方法学实验结果可知，建立的UPLC-MS/MS分析方法方便快捷，精密可靠，可用于定量测定肝微粒体体外孵育体系中代谢产物的浓度。 4.与空白组相比较，生品高剂量组CYP3A4、CYP2C9酶活力显著升高(P＜0.05或P＜0.01)，生品中、低剂量组和炮制品高、中剂量组CYP2D6酶活性显著升高，生品高、中、低剂量组CYP2E1、CYP1A2酶活性显著升高(P＜0.05或P＜0.01)，生品高、中剂量组CYP2C19酶活性显著升高(P＜0.05或P＜0.01)。与生品高剂量组相比较，炮制品高、中、低剂量组CYP3A4、CYP2E1、CYP1A2、CYP2C19酶活力显著降低(P＜0.05或P＜0.01)，生品低剂量组和炮制品高、中剂量组CYP2D6酶活力显著升高（P＜0.05或P＜0.01），炮制品中、低剂量组CYP2C9酶活力显著降低(P＜0.05)。 结论:本文通过Cocktail探针药物法和蛋白免疫印迹法，以细胞色素P450酶为切入点，初步探讨了哥王“汗渍法”炮制后降低大鼠肝脏的毒性机制。综合肝组织病理切片和大鼠血清中ALP、AST、ALT酶活力的变化，结果表明，“汗渍法”炮制后了哥王能有效降低大鼠肝脏毒性，生品肝脏毒性明显大于炮制品;当肝脏出现损伤时，肝脏中CYP3A4、CYP2C 19、CYP2C9、CYP1A2、CYP2E1酶活性有升高趋势，CYP2D6酶活性有降低趋势。因此，初步判断“汗渍法”炮制后，了哥王降低肝毒性机制可能与降低CYP3A4、CYP2C19、CYP2C9、CYP1A2、CYP2E1酶活性，升高CYP2D6酶活性有关。本研究为“汗渍法”炮制了哥王降低肝脏毒性的机制研究提供了依据，为了哥王的安全性和临床应用提供参考。
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