摘要
紫花苜蓿（Medicago sativa L.）是世界范围内被广泛栽培的优质牧草，是我国草牧业的重要组成部分。作为典型的同源四倍体植物，紫花苜蓿具有自交不亲和性的特点，难以通过传统杂交选育技术培育新品种。近年来，基因编辑技术的快速发展以及高质量紫花苜蓿基因组的破译，为培育高产优质紫花苜蓿新品种带来了前所未有的机会。本研究针对四倍体紫花苜蓿基因编辑育种需要攻克的两大关键问题—外植体组织培养再生体系和基因编辑体系构建，开展了技术研究工作，主要结果如下： 1. 建立了适宜多个四倍体紫花苜蓿种质的植物组织培养体系。以 36 个不同遗传背景的紫花苜蓿材料为对象，在其中 35 个材料中实现了以子叶和下胚轴为外植体的愈伤组织发生，平均诱导效率 30.9%；进而在其中 25 个材料中成功实现了完整植株再生，平均再生效率 10.38%。相关性分析显示，胚性愈伤数与植株再生数量存在良好的线性关系，R2=0.8631，认为胚性愈伤的形成是紫花苜蓿外植体分化再生的基础。 2. 探究了影响紫花苜蓿外植体胚性愈伤组织发生和植株再生的关键因素。不同基因型紫花苜蓿胚性愈伤组织诱导效率的聚类结果共分为 3 类，效率区间分别为 61.6%~87.5%（占比 19.4%）、32.4%~49.5%（占比 27.8%）和≤26.6%（占比 52.8%），不同类别的种质材料来源无明显偏向性；在此基础上，与秋眠级的双因素聚类分析呈现 4 个聚类结果，特征分别为高愈伤诱导效率与低秋眠级聚合、较低愈伤诱导效率与最高休眠级聚合、中等愈伤诱导效率与中等休眠级聚合和最低愈伤诱导效率与较低秋眠级聚合，进一步的相关性分析显示胚性愈伤形成效率与秋眠级无明显关系。14 个具优异性状的种质材料胚性愈伤诱导实验结果显示，子叶和下胚轴均是优良的外植体来源，但总体以下胚轴更为适宜，其中 SARDI 10 子叶诱导效率最高，Hunter River 下胚轴诱导效率最高。此外，不同基因型材料在组织培养过程中发生褐化的程度存在显著差异，其中敖汉、Power 5020、陇东和 Spyder 最易发生褐变。 3. 在紫花苜蓿中建立了基于根癌农杆菌介导的基因编辑体系，并进一步对紫花苜蓿中调控复叶发育的关键基因 PALMATE-LIKE PENTAFOLIATE 1 （MsPALM1）进行了定点敲除，成功获得了 mspalm1 基因编辑植株。在紫花苜蓿中克隆得到了 4 个 MsPALM1 等位基因，针对 MsPALM1 基因特异序列设计了 CRISPR/Cas9 精准靶点，通过携带 pMS-CRISPR/Cas9 骨架载体的根癌农杆菌侵染敖汉苜蓿，成功敲除了 MsPALM1 基因并获得 2 株多叶型幼苗。基因组序列分析表明，这 2 株多叶型幼苗的 4 个等位基因均发生突变，其中 1 株（PA4-2）为仅含一种突变类型的纯合子。进一步的表型分析显示，这些基因编辑植株的平均叶面积增加 32.8%。
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