摘要
土壤盐碱化是阻碍全球作物生长和发育的非生物限制因子，对生物圈和生态结构造成严重影响。小球藻是地球上出现最早的单细胞微藻，它作为低等植物，是研究植物在盐碱胁迫下抗逆机制的优良材料。本研究利用课题组前期从东北部盐碱土壤中分离出对高浓度碳酸氢钠环境具有一定适应性的小球藻Chlorella sp. JB6（JB6）为实验材料，以NaHCO3胁迫处理JB6转录组数据分析获得的受NaHCO3高表达的尿素酰胺水解酶（Urea amidolyase，UA）ChDUR1,2基因作为研究对象，探究该基因在响应碳酸盐逆境中所发挥的功能。其主要研究结果如下： 1、成功分离得到小球藻JB6 ChDUR1,2基因，基因全长4987 bp，开放阅读框长度为1020 bp，编码339个氨基酸。通过构建遗传进化树发现，小球藻ChDUR1,2与绿藻的同源性更高，亲缘关系更近。 2、实时荧光定量PCR分析ChDUR1,2对不同逆境胁迫的应答，在Urea、NH4Cl胁迫下ChDUR1,2基因对Urea、NH4Cl都具有一定的响应，随着浓度及处理时间的增加， ChDUR1,2基因表达整体呈现显著性下调表达趋势，ChDUR1,2基因可能通过尿素代谢途径参与小球藻耐盐碱的响应过程。 3、将pYES2-ChDUR1,2重组子转入酿酒酵母INVScI菌株进行碳酸盐逆境胁迫抗性分析。研究发现pYES2-ChDUR1,2转化子在NaHCO3胁迫下的长势明显优于对照组，转化子细胞内的尿素及NH4+含量显著升高。通过向培养基中外源加入不同浓度的Urea或NH4Cl，随着添加浓度的不断升高可以明显促进酵母菌的生长。此外，向含有25 mM NaHCO3的培养基中外源加入Urea或NH4Cl，pYES2-ChDUR1,2转化子的长势明显优于对照组。通过过表达ChDUR1,2基因促进尿素和NH4+的积累，提高酵母菌对NaHCO3胁迫的耐受性。 4、将PLM006-V-BFP-ChDUR1,2重组载体通过基因枪法瞬时转入JB6 ，成功获得过表达ChDUR1,2基因的小球藻。在不同浓度NaHCO3胁迫下，过表达小球藻长势明显优于对照组，过表达植株体内的UA活性、尿素及NH4+含量显著高于对照组。同时，向正常培养基中外源加入不同浓度的Urea或NH4Cl可明显促进小球藻的生长。向含有300 mM NaHCO3的培养基中外源加入不同浓度的Urea或NH4Cl，结果显示过量表达ChDUR1,2基因的小球藻长势明显优于对照组。以上结果表明小球藻ChDUR1,2基因通过参与尿素代谢，促进代谢产物尿素和NH4+的积累，进而增强小球藻对NaHCO3胁迫的耐受性。 综上所述，本研究发现ChDUR1,2基因通过促进尿素代谢产物（尿素NH4+）的积累与利用，可以提高低等生物小球藻对盐碱胁迫的耐受性，有助于进一步深入认识尿素代谢途径与植物耐盐碱性之间的关系。
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