摘要
花期调控是园林植物育种研究的重要方向之一，调节园林植物提前或推迟开花能够延长植物的观赏时间，可提高园林花卉的经济价值和观赏价值。现在越来越多的研究发现植物不同组织部位的 WRKY 转录因子在植物对环境变化的适应中能够调控生长发育过程，包括花期调控。本研究首次开展了燕子花花被片 WRKY 转录因子家族的分析，挖掘到两个与花期调控相关的基因 IlWRKY11 （ GenBank 登录号：ON399551 ）和IlWRKY22（GenBank登录号：ON399552），并进行了基因克隆、生物信息学分析，通过烟草和拟南芥的异源转化进行花期调控功能的验证。本研究成果为解析燕子花花期调控机理及 WRKY 转录因子的开发利用研究奠定了基础，也为花期调控育种实践提供了新的基因资源。研究成果如下： （1）通过对燕子花花被片的转录组数据分析，筛选得到68条IlWRKY转录因子家族的成员，分析保守结构域和锌指结构发现分布在在WRKY家族3大组中，第Ⅰ组有22条序列；第Ⅱ组有35条序列，其中5条序列属于第Ⅱa组，7条序列属于第Ⅱb组，第Ⅱc组只有1条序列，13条序列属于第Ⅱd组，9条序列属于第Ⅱe组；第Ⅲ组有11条序列。可能参与生物、非生物胁迫的响应和调节生长发育等功能调控。 （2）参与花期调控的IlWRKY转录因子主要分布在第Ⅱc、Ⅱd、Ⅱe组。通过相似度较高的同源 WRKY 蛋白的功能分析，筛选出可能筛选出可能参与花期调控的 isoform 287969和isoform 51755作为研究对象，命名为IlWRKY11和IlWRKY22。 （ 3 ）以燕子花总 RNA 反转录得到的 cDNA 为模板，克隆获得 IlWRKY11 和IlWRKY22 的基因序列，长度分别为 888bp 和 840bp，编码 295 和 279 个氨基酸。生物信息学分析表明 IlWRKY11 蛋白的分子量是 32.291kDa，理论等电点为 9.76，分子式为C1398H2237N419O421S20；IlWRKY22 蛋白的分子量是 30.604kDa，理论等电点为 5.02，分子式为 C1314H2065N383O435S13。都属于不稳定亲水性蛋白，不存在跨膜结构和信号肽，都具有2个糖基化位点且以丝氨酸的磷酸化为主。同源比对功能预测IlWRKY11蛋白可能在植物的生物胁迫、非生物胁迫、生长发育和花期调控等过程发挥作用；IlWRKY22 蛋白可能参与生物胁迫、叶片衰老和开花时间等功能的调控。 （4）构建了pCAMBIA1300-IlWRKY11-GFP和pCAMBIA1300-IlWRKY22-GFP植物过表达载体，并通过冻转法转入到农杆菌 GV3101 中，用注射本式烟草叶片的方法确认了 IlWRKY11 和 IlWRKY22 蛋白定位在细胞核中，与预测结果一致；用蘸花法转入到拟南芥中、叶盘法转入到烟草中，通过 PCR 鉴定确认目的基因都成功插入到拟南芥和烟草的基因组，采用 qRT-PCR 的方法筛选获得拟南芥 T3 代和烟草 T1 代的高表达株系。 （5）确定 IlWRKY11 和 IlWRKY22 基因参与花期调控：IlWRKY11 基因能够正调控拟南芥的开花，抽薹时间和开花时间比对照早了 2 到 3 天；IlWRKY22 基因推迟拟南芥的开花，抽薹时间和开花时间比对照晚了3.5天；对照和转IlWRKY11和IlWRKY22基因的拟南芥莲座叶数量分别为 14.5、13.3 和 18.1，和开花时间存在相关性。IlWRKY22 基因也延迟了烟草的开花时间。两个基因在成花调控中作用相反。 （6）通过对转基因拟南芥和转空载对照的成花期相关基因表达的 qRT-PCR 检测，发现IlWRKY11、IlWRKY22基因都是通过GA20OX基因的高表达和其他途径信号的共同作用参与花期调控的，可能影响年龄途径 SPL3 的表达决定拟南芥幼年期的长短，或者是春化途径VRN1的表达差异影响的，导致了不同的作用结果。
NETL