摘要
菊花是菊科菊属的多年生宿根草本植物，种植方式通常以设施连作为主。而这种多年连作模式也引发了严重的连作障碍，导致枯萎病频发，经济损失巨大。本研究主要针对河南新乡当地切花菊“光育”品种的连作枯萎病害现象，从连作菊花根际土壤分离致病菌，对其入侵及定殖方式、致病力以及对植株产生的生理胁迫开展研究，结合连作土壤微生物群落结构的变化进行分析。探究当地连作引起的枯萎病的发生原因及发病机理，为菊花枯萎病的防治以及解决菊花连作障碍提供新的思路。 本文通过对当地菊花连作发生大田的菊花发病情况及株高叶宽等生长指标的调查统计发现，当地菊花连作枯萎病发生严重，发病率达80%以上。随后，从七年连作的枯萎病田土壤中分离纯化致病菌，利用形态学和分子生物学方法以及科赫法则进行验证，确定引起当地切花菊枯萎病的病原菌为镰刀菌属（Fusarium）的腐皮镰刀菌（Fusarium solani），这也是首次在该品种上报道F. solani。对其分泌的细胞壁降解酶（Cell wall degrading enzyme，CWDE）中的纤维素酶、果胶酶及木聚糖酶的产生能力进行测定，发现该菌株具备植物细胞壁降解能力。结合实验室条件下的盆栽实验，利用根系麦胚凝集素与 AF488 的偶联物（Wheat germ agglutinin amp; Alexa Fluor? 488 conjugate，WGA-AF488）和碘化丙啶（Propidium iodide，PI）共染色技术，通过电子扫描显微镜（Scanning electron microscopy， SEM）及激光共聚焦扫描显微镜（Laser confocal scanning microscopy，LCSM）观察F. solani在植物根系的入侵及定殖，研究结果初步确定，病原菌对植物的侵染从根系开始，产生可破坏植物细胞壁结构的细胞壁降解酶，沿着根系伤口、根尖及细胞间隙侵入，在根系内部及维管束组织中大量定殖，影响植物水分及营养运输通道，造成植株死亡。 同时对菊花侵染初期至发病初期的一系列生理指标进行测定。研究结果发现，从侵染开始至病症出现，菊花体内生理指标呈现规律性变化。病原菌的侵染导致植物体内的活性氧爆发，过氧化物酶（Peroxidase，POD）和过氧化氢酶（Catalase，CAT ）首先参与响应，清除体内多余的活性氧，维持细胞稳态；随后水杨酸（Salicylic acid, SA）、钙和蛋白含量增加，多酚氧化酶（Polyphenol oxidase，PPO）、苯丙氨酸解氨酶（Phenylalanine ammonialyase，PAL）和几丁质酶（Chitinase，CHI）活性在不同时期显著增强，植物防御系统开始响应病菌的侵害，并产生可溶性糖、蛋白等物质以增强植物抗性。随着侵染程度的进一步加深，植物体内开始积累大量过氧化氢，丙二醛（Malondialdehyde，MDA）含量显著增加，细胞膜破坏严重，体内营养物质及光合色素开始流失，直至植株出现病症，进而整株死亡。研究初步表明，植物在病原菌侵染发生初期自身具有一定的抗病性，随着侵染的加剧，自身免疫反应不足以抵抗病原菌的毒害，生理代谢活动开始紊乱，营养物质流失，毒害物质大量积累，从而导致植株死亡。 最后利用PacBio单分子实时（SMRT）测序技术对7年连作土壤的微生物群落组成结构变化进行分析。分析结果发现，土壤中藤黄单胞菌属（Luteimonas）、放线菌属（Actinomarinales）、曲霉属（Aspergillus）等病原菌拮抗微生物以及蓝细菌属、角担菌属（Ceratobasidium）、圆酵母属（Torula）等有益微生物丰度显著降低，而腐皮镰刀菌（F. solani）、粪盘菌属（Ascobolus）、多球菌属（Myriococcum）等病原菌以及腐生真菌的相对丰度显著增加。研究初步推断，腐生菌及有害病原菌丰度和多样性增加，有益微生物丰度降低，造成微生物区系产生显著变化，可能是切花菊连作枯萎病发生的另一重要原因。
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