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基于miR-139-5p/FoxO1/Keap1/Nrf2通路探讨人参皂苷Rd对脑缺血再灌注损伤后细胞焦亡的影响及机制
姚懿芹1
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摘要
目的：缺血性脑卒中是以脑循环血流量减少为特征的脑血管疾病，以其发病率高、致残率高及病死率高已成为威胁人类健康的“三大杀手”之一。近年来研究表明，脑缺血再灌注损伤可能与神经元发生细胞焦亡有关。人参皂苷 Rd 能够保护神经元免受脑缺血后再灌注损伤，但其具体的保护机制较为复杂，目前尚未完全阐释清楚。因此，本研究以细胞焦亡为切入点，从体内和体外两个层面探讨人参皂苷Rd对脑缺血再灌注损伤的作用机理，为把人参皂苷 Rd开发成有效的抗脑缺血神经保护剂提供科学理论依据。 方法：1、体内实验：取 6-8周龄 SPF级雄性 C57BL/6小鼠随机分为 7组：假手术组（ Sham ）、脑缺血再灌注组（ MCAO/R ）、人参皂苷 Rd 低剂量组（ 10 mg/kg）、人参皂苷Rd中剂量组（20 mg/kg）、人参皂苷Rd高剂量组（40 mg/kg）、人参皂苷 Rd（40 mg/kg）+Nrf2 抑制剂（ML385）组、人参皂苷 Rd（40 mg/kg）+miR-139-5p拮抗剂（miR-139-5p antagomir）组，每组96只。除Sham组外，其余各组采用线栓法建立小鼠大脑中动脉闭塞/再灌注（MCAO/R）模型。人参皂苷 Rd干预组分别在造模前 30 min腹腔注射低、中、高剂量人参皂苷 Rd。人参皂苷 Rd+Nrf2抑制剂组在给予40 mg/kg人参皂苷Rd干预的基础上造模前90 min经腹腔注射30 mg/kg ML385。人参皂苷Rd（40 mg/kg）+miR-139-5p拮抗剂组在给予40 mg/kg人参皂苷Rd干预的基础上在造模前3天经侧脑室内注射miR-139-5p antagomir。再灌注24 h后，采用Longa神经评分系统对小鼠神经功能缺陷进行评分，TTC染色测定脑梗死百分比，计重法测定脑含水量，Nissl染色测定脑皮层组织神经元的形态学变化，免疫荧光法测定脑皮层组织细胞焦亡的情况， DCFH-DA 荧光探针法检测脑皮层组织内ROS的含量，免疫荧光法检测脑皮层组织内NLRP3与TXNIP的共定位情况，RT-PCR 检测脑皮层组织内 miR-139-5p、FoxO1、Keap1、NLRP3、ASC、Caspase-1mRNA表达水平，Western blot检测脑皮层组织内FoxO1、Keap1、总Nrf2、核内 Nrf2、HO-1、NQO1、Trx1、NLRP3、ASC、Caspase-1、GSDMD 的蛋白表达水平，ELISA法检测脑组织内炎症因子IL-18和IL-1β的分泌水平。 2、体外实验：无菌条件下，从怀孕18天的C57BL/6孕鼠胚胎中提取原代皮层神经元，正常培养 1 周后将神经元随机分为 10 组：对照组（ Control ）、模型组（OGD/R）、人参皂苷 Rd低剂量组（5 μM）、人参皂苷 Rd中剂量组（10 μM）、人参皂苷 Rd 高剂量组（ 20 μM ）、人参皂苷 Rd （ 20 μM ）+FoxO1 过表达质粒（pcDNA3.1-FoxO1）转染组、pcDNA3.1-FoxO1 转染组、FoxO1-shRNA 慢病毒载体转染组、miR-139-5p模拟物（miR-139-5p mimic）转染组、miR-139-5p抑制物（miR-139-5p inhibitor）转染组。采用MTT法检测细胞活力，LDH法检测细胞损伤，流式细胞术检测神经元焦亡水平，DCFH-DA荧光探针法检测神经元内 ROS的含量，免疫共沉淀法（Co-IP）检测神经元内 NLRP3 与 TXNIP 的相互作用，RT-PCR 检测神经元内 miR-139-5p、FoxO1、Keap1、NLRP3、ASC、Caspase-1 mRNA表达水平，Western blot检测神经元内FoxO1、Keap1、总Nrf2、核内Nrf2、HO-1、NQO1、Trx1、NLRP3、ASC、Caspase-1、GSDMD 的蛋白表达水平，ELISA 法检测细胞上清液中炎症因子 IL-18 和 IL-1β 的分泌水平，双荧光素酶报告基因验证miR-139-5p靶向负调控FoxO1，染色质免疫共沉淀法（ChIP）检测FoxO1与Keap1基因启动子区域的结合水平。 结果：体内实验：1、不同剂量（10、20、40 mg/kg）人参皂苷 Rd干预后可显著改善小鼠神经功能缺陷，明显降低脑梗死体积和脑水肿比例，并改善脑组织皮层神经元的损伤情况，使其形态恢复与假手术组近似。其中，40 mg/kg 人参皂苷 Rd效果最佳。2、不同剂量（10、20、40 mg/kg）人参皂苷 Rd干预后可显著降低小鼠脑组织内神经元焦亡比例、焦亡相关蛋白 NLRP3、ASC、Caspase-1 p20、GSDMD-N的蛋白表达水平、IL-18和IL-1β的分泌水平、细胞内ROS的含量以及TXNIP与NLRP3 的共定位水平。其中， 40 mg/kg 人参皂苷 Rd 效果最佳。3、不同剂量（ 10、20、40 mg/kg ）人参皂苷 Rd 干预后可明显下调小鼠脑组织内 Keap1 的mRNA 及蛋白表达水平，且显著上调 Nrf2 的核转位水平以及 Nrf2 下游 HO-1、NQO1、Trx1 的蛋白表达水平。其中，40 mg/kg 人参皂苷 Rd 效果最佳。4、使用Nrf2抑制剂 ML385后，40mg/kg人参皂苷 Rd对细胞焦亡比例、焦亡相关蛋白表达水平、IL-18和IL-1β分泌水平、细胞内ROS含量、TXNIP与NLRP3共定位水平的抑制作用被ML385逆转。5、人参皂苷 Rd呈剂量依赖性方式上调miR-139-5p的表达水平，但MCAO/R小鼠经侧脑室内注射miR-139-5p antagomir后，40 mg/kg人参皂苷 Rd 对细胞焦亡、焦亡相关蛋白表达水平、IL-18 和 IL-1β 分泌水平、细胞内ROS含量、TXNIP与NLRP3共定位水平的抑制作用被miR-139-5p antagomir逆转。 体外实验：1、不同浓度（5、10、20μM）人参皂苷Rd处理后可显著改善原代皮层神经元的细胞活力，并明显降低神经元的细胞损伤水平。其中，20 μM 人参皂苷 Rd效果最好。2、不同浓度（5、10、20 μM）人参皂苷 Rd处理后可显著降低神经元细胞焦亡比例、焦亡相关蛋白 NLRP3、ASC、Caspase-1 p20、GSDMD-N的蛋白表达水平、IL-18和IL-1β的分泌水平、细胞内ROS的含量以及TXNIP与NLRP3的相互作用。其中，20μM人参皂苷Rd效果最好。3、不同浓度（5、10、20μM）人参皂苷Rd处理后可明显下调神经元内Keap1的mRNA及蛋白表达水平，且显著上调 Nrf2 的核转位水平以及 Nrf2 下游 HO-1、NQO1、Trx1 的蛋白表达水平。其中，20 μM 人参皂苷 Rd 效果最好。4、人参皂苷 Rd 呈剂量依赖性方式上调 miR-139-5p的表达水平。MiR-139-5p mimic可明显提高神经元的细胞活力，并显著降低神经元细胞损伤、细胞焦亡比例、焦亡相关蛋白 NLRP3、ASC、Caspase-1 p20、GSDMD-N 蛋白表达水平、IL-18 和 IL-1β 分泌水平、细胞内 ROS 的含量以及TXNIP与NLRP3的相互作用。同时，MiR-139-5p mimic可靶向负调控FoxO1，即明显降低FoxO1mRNA及蛋白表达水平。然而，MiR-139-5p inhibitor的作用恰好与miR-139-5p mimic相反。5、过表达FoxO1的神经元内Keap1的mRNA和蛋白表达水平明显升高，Nrf2的荧光酶活性以及HO-1 HO-1、NQO1、Trx1蛋白表达水平明显降低，且FoxO1与Keap1启动子区域的结合水平明显增强。然而，沉默神经元内FoxO1 后与上述情况相反。5、过表达 FoxO1 可明显逆转 20 μM 人参皂苷 Rd 对Keap1 表达的下调作用以及对 Nrf2 核转位水平及其下游基因 HO-1、NQO1、Trx1表达的上调作用。此外，过表达FoxO1可逆转20 μM人参皂苷Rd对细胞焦亡相关蛋白表达水平、IL-18 和 IL-1β 分泌水平、细胞内 ROS 含量、细胞焦亡比例、TXNIP与NLRP3相互作用的抑制作用。 结论：人参皂苷 Rd 对脑缺血再灌注损伤后神经元具有保护作用，并且此作用与上调miR-139-5p表达水平，降低FoxO1与Keap1表达水平，进而激活Nrf2抗氧化信号通路，抑制ROS-TXNIP-NLRP3炎症小体轴诱导的细胞焦亡有关。
关键词
人参皂苷Rd/脑缺血再灌注损伤/细胞焦亡/非编码RNA-139-5p/NLRP3炎症小体/神经保护作用引用本文复制引用
授予学位
硕士学科专业
药物化学导师
丁海燕学位年度
2022学位授予单位
新疆医科大学语种
中文中图分类号
R2