摘要
目的： 通过动物体内实验和细胞体外实验，从多角度、多靶点探讨不同时间点益气养阴活血通络法对特发性肺纤维化TGF-β1/Smads信号传导通路以及细胞凋亡的调控作用，并讨论两者的相关性，以加深阐述特发性肺纤维化的作用机制，为临床诊治特发性肺纤维化提供新的科学依据和诊疗经验。 方法： 1 动物实验研究 1.1 博莱霉素造模 1.2将144只SPF级Wistar雄性大鼠随机分为六组，即空白对照组、模型对照组、西药组、中药高剂量组、中药中剂量组和中药低剂量组，于7d、14d、28d三个时间点进行实验取材和指标测定。 1.3 肺组织病理形态测定 通过HE染色和Masson染色行光镜下观察，并依据评分标准进行病理形态分析。 1.4羟脯氨酸、α-SMA蛋白和mRNA含量的测定： 碱水解法测定羟脯氨酸含量，分析益气养阴活血通络法对胶原纤维形成和胶原蛋白沉积的影响。通过免疫组化、Western-blot法及RT-PCR的方法，多层次、多角度揭示不同时间点血清中α-SMA蛋白和mRNA的动态表达，阐明益气养阴活血通络法具有下调α-SMA蛋白及mRNA表达的作用，从而治疗肺纤维化。 1.5 益气养阴活血通络法干预IPF模型大鼠TGF-β1/Smads信号传导通路的研究 通过免疫组化、Western-blot法及RT-PCR的方法，多层次、多角度揭示不同时间点肺组织TGF-β1、Smad2、Smad4、Smad7蛋白和mRNA的动态表达，阐明益气养阴活血通络法调控IPF模型大鼠TGF-β1/Smads信号通路的机制。 1.6益气养阴活血通络法干预IPF模型大鼠细胞凋亡的研究 通过TUNEL染色方法测肺组织中细胞凋亡情况，又通过Western-blot法及RT-PCR的方法，多层次、多角度揭示不同时间点肺组织Bax、Bcl-2、Fas、Fas L、CasPase-3蛋白和mRNA的动态表达，阐明益气养阴活血通络法调控IPF模型大鼠细胞凋亡的机制。 2 细胞实验研究 2.1 采用胰蛋白酶消化法原代提取与培养肺成纤维细胞 2.2 肺成纤维细胞分组培养 将肺成纤维细胞分为模型组、西药组、中药组和抑制剂组四组，其中模型组给予正常血清组血清的模型对照组大鼠肺成纤维细胞，中药组给予益气养阴活血通络法之中药复方含药血清干预的模型对照组大鼠肺成纤维细胞，西药组给予西药含药血清干预的模型对照组大鼠肺成纤维细胞，抑制剂组给予TGF-β1抑制剂LY210976的模型对照组大鼠肺成纤维细胞。于24h、48h、72h三个时间点进行实验指标测定。 2.3 免疫荧光法检测波形蛋白的表达及定位，鉴定肺成纤维细胞 2.4 益气养阴活血通络法干预肺成纤维细胞TGF-β1/Smads信号传导通路的研究 通过Western-blot法及RT-PCR的方法，多层次、多角度揭示不同时间点肺成纤维细胞TGF-β1、Smad2、Smad4、Smad7蛋白和mRNA的动态表达，阐明益气养阴活血通络法调控肺成纤维细胞TGF-β1/Smads信号通路的机制。 2.5益气养阴活血通络法干预肺成纤维细胞凋亡机制的研究 通过流式细胞仪检测细胞凋亡情况，又通过Western-blot法及RT-PCR的方法，多层次、多角度揭示不同时间点肺成纤维细胞中Bax、Bcl-2、Fas、Fas L、CasPase-3蛋白和mRNA的动态表达，阐明益气养阴活血通络法调控肺成纤维细胞凋亡机制。 结果： 1 动物实验研究 1.1体内实验动物模型复制成功 1.2益气养阴活血通络法可以改善大鼠的一般状态，能有效抑制早期肺泡炎，改善中晚期肺内纤维化沉积，改善大鼠肺组织病理形态（P﹤0.01或P﹤0.05）。 1.3 益气养阴活血通络法能够有效降低羟脯氨酸以及ɑ-SMA含量，减轻胶原纤维的含量，抑制细胞外基质的过度沉积，延缓肺纤维化。 1.4 益气养阴活血通络法能够抑制TGF-β1/Smads信号通路中发挥效应的TGF-β1、Smad2、Smad4蛋白及mRNA的高表达，促进该通路中发挥负性调控效应的Smad7蛋白及mRNA表达上调，发挥调控TGF-β1/Smads信号通路的作用，延缓肺纤维化进程，且中剂量的效果最佳。与空白对照组相比，模型对照组大鼠肺组织中TGF-β1、Smad2、Smad4的蛋白和mRNA表达明显上调（P﹤0.01或P﹤0.05），而Smad7蛋白和mRNA表达明显下调（P﹤0.01或P﹤0.05），证实Smad2与Smad7竞争性抑制关系；经过药物治疗后，与模型对照组比较，给药各组大鼠肺组织中TGF-β1、Smad2、Smad4的蛋白和mRNA表达均有不同程度的下调（P﹤0.01或P﹤0.05），同时Smad7蛋白和mRNA表达也有一定的上调（P﹤0.01或P﹤0.05），说明西药泼尼松片与益气养阴活血通络法的中药复方均具有调节Smad2与Smad7竞争性抑制关系作用；与西药组比较，中药中剂量组大鼠肺组织中TGF-β1、Smad2、Smad4、Smad7的蛋白和mRNA表达水平无统计学差异（Pgt;0.05），中药高剂量与低剂量组表达情况具有统计学差异（P﹤0.01或P﹤0.05）。1.5益气养阴活血通络法能够抑制细胞凋亡，主要是通过对Bax/Bcl-2Fas/FasL介导的细胞凋亡途径，并共同作用于CasPase家族起到促进成纤维细胞的过度凋亡，延缓肺纤维化的进程。与空白对照组比较，造模后的各组凋亡细胞数均增加（P﹤0.01）；与模型对照组比较，药物干预后凋亡细胞数均减少（P﹤0.01），提示西药泼尼松片与益气养阴活血通络法之中药复方具有抑制细胞凋亡的作用。与空白对照组相比，模型对照组大鼠肺组织中Bax的蛋白和mRNA表达明显上调（P﹤0.01），而Bcl-2蛋白和mRNA表达明显下调（P﹤0.01），证实Bax与Bcl-2相互抑制。与模型对照组比较，经药物干预的各组大鼠肺组织中的Bax蛋白和mRNA表达均有不同程度的下调（P﹤0.01或P﹤0.05），同时Bcl-2蛋白和mRNA表达也有一定的上调（P﹤0.01或P﹤0.05），说明西药泼尼松片与益气养阴活血通络法之中药复方均有治疗作用。与西药组比较，中药中剂量组肺组织中Bax、Bcl-2的蛋白和mRNA表达水平无统计学差异(Pgt;0.05)，提示中药中剂量组与西药泼尼松片的治疗效果相同，而中药高剂量与低剂量组表达具有统计学差异（P﹤0.01或P﹤0.05），提示两者效果欠佳。与空白对照组相比，模型对照组大鼠肺组织中Fas、Fas L、CasPase-3的蛋白和mRNA表达明显上调（P﹤0.01），说明在肺纤维化形成过程中，存在Fas、FasL、CasPase-3蛋白以及mRNA表达增强；经过药物治疗后，各组大鼠肺组织中的Fas、FasL、CasPase-3蛋白和mRNA表达均有不同程度的下调（P﹤0.01或P﹤0.05），说明西药泼尼松片与益气养阴活血通络法之中药复方均有调节以上因子的作用。与西药组比较，中药中剂量组大鼠肺组织中Fas、Fas L、CasPase-3的蛋白和mRNA表达水平无统计学差异，提示两者效果相同。而中药高剂量与低剂量组表达具有统计学差异（P﹤0.01或P﹤0.05），提示两者效果欠佳。 2 动物体外实验部分 2.1 胰蛋白酶消化法成功提取并培养肺成纤维细胞 2.2 荧光免疫细胞化学染色法检测显示波形蛋白的定位于胞浆，波型蛋白染色阳性，阳 性率在95%以上。 2.3 益气养阴活血通络法之中药复方含药血清能够有效抑制肺成纤维细胞内TGF-β1/Smads信号通路中发挥效应的TGF-β1、Smad2、Smad4蛋白及mRNA的高表达，促进该通路中发挥负性调控效应的Smad7蛋白及mRNA表达上调，发挥调控TGF-β1/Smads信号通路的作用，延缓肺纤维化进程。实验结果表明，与模型组相比，经药物干预的各组细胞中Smad2、Smad4的蛋白和mRNA表达在三个时间点内均有明显下调（P﹤0.01）；Smad7蛋白和mRNA在则明显上调（P﹤0.01），证实西药泼尼松片与益气养阴活血通络法均调节上述因子的作用。 结论： 1. 益气养阴活血通络法可能通过下调肺组织TGF-β1、Smad2、Smad4含量和上调Smad7含量调控TGF-β1/Smads信号通路，同时通过下调Bax、Fas、FasL、CasPase-3含量和上调bcl-2含量抑制肺泡上皮细胞凋亡，从而延缓IPF进展。 2.益气养阴活血通络法可能通过下调肺成纤维细胞TGF-β1、Smad2、Smad4含量和上调Smad7含量调控TGF-β1/Smads信号通路，同时通过上调Bax、Fas、Fas L、CasPase-3含量和下调bcl-2含量促进肺成纤维细胞凋亡，从而延缓IPF进展。 3. 益气养阴活血通络法调控细胞凋亡相关蛋白的作用，可能是通过调节TGF-β1/Smads信号通路而实现的，进而延缓IPF进展。
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