摘要
目的:结直肠癌的发病率逐年增加，虽现有的抗肿瘤药物及方法能使晚期结直肠癌(metastatic colorectal cancer，mCRC)的生存时间已达到30月左右，但总体预期生存率仍然很低，且部分化疗药物还存在不良反应;研究发现不同错配修复基因类型结直肠癌在恶性程度、预后及转移风险不同，我们前期实验发现两种基因类型肿瘤细胞在细胞自噬活性上明显有差别:与dMMR-mCRC相比，pMMR-mCRC肿瘤细胞具有更高自噬活性。随着中医药研究的发展，发现土家药蜚蠊有抗肿瘤及组织修复等作用，而蜚蠊在不同错配修复基因类型结直肠癌中抗肿瘤效果的研究尚无报道。所以，本课题通过蜚蠊和卡培他滨单独或联合的应用，以探究蜚蠊对不同错配修复基因类型结直肠癌的自噬调控机制，以及与卡培他滨联用后探究蜚蠊的抗肿瘤辅助作用。 方法:(1)实验采用CRISPR-Cas9基因编辑技术敲除鼠源细胞CT26中的MLH1基因，成功构建CT26-dMMR稳转细胞株供后续实验研究;(2)通过血清药理学研究方法制备蜚蠊含药血清;(3)细胞实验分为四组:空白对照组(NC)、蜚蠊组(FL)、卡培他滨组(CAP)、联合用药组(FL+CAP)，通过MTT实验探究蜚蠊和卡培他滨对CT26-pMMR和CT26-dMMR细胞的抑制作用及对两种细胞抗肿瘤抑制作用的差异性研究;通过Western Blot实验探究蜚蠊和卡培他滨对CT26-pMMR和CT26-dMMR细胞及动物模型自噬相关蛋白表达水平的影响;(4)动物实验选择利用BALB/c小鼠皮下接种CT26-pMMR和CT26-dMMR细胞以构建皮下移植瘤动物模型，检测蜚蠊和卡培他滨对不同MMR基因类型的皮下移植瘤小鼠肿瘤生长抑制作用。实验动物随机分为四组:空白对照组(NC)，蜚蠊组(FL)，卡培他滨组(CAP)，联合用药组(FL+CAP)，在分别予以不同的用药处理后，观察不同MMR基因类型移植瘤的抑瘤效应，通过Western Blot及免疫组化实验探究不同药物对移植瘤组织自噬的影响。 结果:(1) Western Blot检测MLH1蛋白在CT26-dMMR细胞中不表达，表明CT26-dMMR中的MLH1基因被敲除，成功构建了鼠源CT26-dMMR细胞株。(2) MTT法检测发现FL浓度为6％时对CT26细胞有明显抑制作用（P＜0.05），但是对不同MMR类型CT26细胞的抑制作用无明显差异(P＞0.05);CAP对CT26-pMMR和CT26-dMMR细胞均有抑制作用且呈浓度依赖性，且对两细胞的抑制作用无差异（P＜0.05）;通过该实验结果得到CAP对CT26-pMMR和CT26-dMMR细胞作用24h时，IC50值CT26-pMMR为1.997±0.144μM，CT26-dMMR为2.097±0.135μM，故确定后续细胞实验的用药浓度FL为6％、CAP为2μM。(3) Western Blot和免疫组化检测p62、Beclin 1、Bcl-2、LC3蛋白表达情况;细胞Western Blot显示:FL下调了CT26-PMMR细胞Beclin 1蛋白表达（P＜0.05），下调了CT26-dMMR细胞LC3蛋白表达(P＜0.05); CAP下调了CT26-pMMR细胞中Beclin 1和LC3蛋白表达(P＜0.05)，使CT26-dMMR细胞中p62、Bcl-2蛋白的表达上调(P＜0.05)、LC3蛋白的表达下调(P＜0.05); FL和CAP联合使用下调了CT26-pMMR细胞Beclin 1、LC3蛋白表达（P＜0.05），使CT26-dMMR细胞中p62、Beclin 1蛋白表达上调（P＜0.05）、LC3蛋白表达下调(P＜0.05);肿瘤组织Western Blot结果显示:FL使pMMR肿瘤中p62蛋白表达上调(P＜0.05)、LC3蛋白表达下调(P＜0.05); CAP使pMMR肿瘤中p62、Beclin 1、Bcl-2蛋白表达上调（P＜0.05）、LC3表达下调（P＜0.05），使dMMR肿瘤中Beclin 1、Bcl-2蛋白表达上调(P＜0.05); FL和CAP联合处理使pMMR肿瘤中p62、Beclin 1、Bcl-2蛋白表达上调(P＜0.05)、LC3蛋白表达下调(P＜0.05)，使dMMR肿瘤中Beclin 1、Bcl-2蛋白表达上调(P＜0.05)、LC3蛋白表达下调(P＜0.05)。肿瘤组织免疫组化结果显示:与pMMR模型NC组（p62:1.2分、Beclin 1:1.5分、Bcl-2:1.4分、LC3:3.3分）相比，FL使pMMR中p62（2.1分）阳性表达更加显著、Beclin 1（1.3分）、Bcl-2（1.1分）、LC3（2.5分）阳性表达降低，CAP组和FL+CAP组均使pMMR中p62（2.9、3.1分）、Beclin 1(2.4、2.8分)、Bcl-2（3.1、3.5分）阳性表达增加，LC3（2.8、2.1分）阳性表达降低;与dMMR模型NC组（p62:2.2分、Beclin 1:2.3分、Bcl-2:2.0分、LC3:2.1分）相比，FL组、CAP组和FL+CAP组均使dMMR中p62（2.5、2.7、3.3分）、Beclin 1（2.7、3.0、3.7分）、Bcl-2（2.8、3.4、4分）阳性表达更加显著，LC3 (1.7、1.9、1.4分)阳性表达降低。以上结果提示FL和CAP单独或联合使用对CT26-pMMR和CT26-dMMR细胞及皮下移植瘤模型均有不同自噬抑制作用，而这种抑制作用可能是其促进凋亡的作用的重要机制。(4)动物体内实验显示FL组抑瘤率为pMMR (18.47％)、dMMR(21.08％)，CAP组抑瘤率为pMMR(56.02％)、dMMR (58.86％)，FL+CAP组抑瘤率为pMMR (67.1％)、dMMR(69.27％)，结果提示FL和CAP对CT26-pMMR和CT26-dMMR小鼠移植瘤模型肿瘤发生发展均有抑制作用，两药联用后这种抑瘤作用协同增加，在pMMR和dMMR两种模型中抑制效果均无差异，其中CAP的抑瘤作用明显比FL抑瘤作用强（P＜0.05）。 结论:(1) FL和CAP对结直肠癌均有抗肿瘤作用，两药联用后抗肿瘤作用协同增加，而对不同错配修复基因类型的结直肠癌抑瘤作用无明显差异;(2) FL和CAP对结直肠癌CT26均有自噬抑制作用，而且两药分别对不同错配修复基因类型结直肠癌均存在不同程度的自噬抑制作用，两药联用后自噬抑制作用协同增加;(3) FL和CAP对结直肠癌的肿瘤抑制作用可能与抑制自噬活性而协同促进凋亡有关。
NETL