摘要
红松（Pinus koraiensis）是松科松属植物，具有重要的经济和生态价值。在以往的红松体胚发生研究中，已经基本建立了红松体胚发生与植株再生体系，但是因繁殖材料和培养条件不同，红松体胚发生增殖过程存在显著差异，这成为其规模化扩繁的一个阻碍。抗坏血酸（ASA）是植物体内重要的抗氧化剂，已有许多研究证明外源添加ASA对植物体胚发生过程起促进作用。本研究以不同增殖能力的三种红松胚性细胞系为材料，通过在红松胚性细胞增殖培养基中添加不同浓度 ASA，探究了外源 ASA 添加对红松胚性愈伤组织增殖率、内源ASA-GSH循环和ROS代谢过程关键物质含量及相关酶活性、内源激素水平以及增殖过程中相关基因的相对表达量的影响，确定了最适宜红松胚性愈伤组织增殖的外源ASA处理浓度以及相关的生理和分子机制。主要结论如下： （1）外源 ASA 依赖浓度显著影响红松不同细胞系胚性愈伤组织的增殖，呈现出低浓度促进高浓度抑制的趋势，其中20 mg/L和50 mg/L ASA的促进效果最好，增殖率可达372.5%-480%（均显著高于其他浓度），而200 mg/L ASA则显著抑制了增殖（增殖率为137.5%-155%）； （2）外源 ASA 的添加降低了红松胚性细胞内源 H2O2含量，促进了红松胚性细胞内部的ASA-GSH循环，使其内源ASA、GSH含量增加，APX、GR酶活性提高；降低了DHA和GSSG的含量，并且提高了ASA/DHA以及GSH/GSSG。其中20 mg/L或50 mg/L ASA 的处理效果最显著，此时三个细胞系内源 H2O2 含量与对照相比分别下降了36.0%、59.2%、69.4%，ASA 含量分别提高了 167%、770%、905%，而 GSH 含量分别提高了185%、206%、188%。 （3）外源ASA的添加使红松胚性细胞内源激素发生变化。不同浓度外源ASA处理相同时间的红松胚性细胞中，50 mg/L ASA处理后其内源IAA含量最低，在第14d与对照相比下降了2.1%；而200 mg/L处理的材料其内源IAA、ZR含量最高，在第14d与对照相比分别提高了8.2%和12.4%，ABA含量最低，与对照相比降低了33.4%。而相同浓度处理不同时间的红松胚性细胞中，其内源IAA和ABA含量随着天数的增加而减少， ZR含量随着天数的增加而增加； （4）外源 ASA 的添加使红松胚性细胞增殖过程相关基因的表达量发生变化。其中50 mg/L 外源ASA处理后提高了ASA代谢相关基因表达量，降低了活性氧代谢和生长素信号转导相关基因表达量；而200 mg/L外源ASA处理后提高了活性氧代谢和生长素信号转导相关基因表达量，降低了ASA代谢相关基因表达量。实时定量荧光PCR得到的基因相对表达量与所测定各种生理指标结果相一致。 综上所述，本文从生理和分子两方面确定了最有利于红松胚性愈伤组织增殖的外源ASA浓度为50 mg/L，得到了外源ASA对红松胚性细胞增殖的生理机制，即外源ASA通过提高ASA、GSH含量，APX、GR酶活性，从而促进细胞内源ASA-GSH循环，增加了 ASA/DHA 和 GSH/GSSG，清除红松胚性细胞内源 H2O2等活性氧，使细胞内部处于一个还原的环境，并且降低了内源IAA水平，最终促进红松胚性细胞的增殖。为后续红松的遗传转化研究提供依据，优化了红松体胚发生途径的高效规模化繁殖技术。
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