摘要
放射治疗（radiotherapy，RT）是肿瘤临床治疗的主要手段之一，约70 %患者在治疗过程中会接受根治性或姑息性 RT，尤其是对不可手术切除的患者。然而，由于乏氧、异常DNA损伤修复、凋亡逃逸、免疫逃逸、肿瘤异质性、肿瘤干细胞再生等肿瘤自身以及微环境因素导致辐射抵抗。因此，如何有效的提高肿瘤细胞的RT敏感性并降低对正常组织的毒副作用仍是肿瘤放射治疗亟待解决的难题。目前已有针对乏氧细胞的硝基咪唑类增敏剂，如哌莫硝唑、尼莫拉唑、甘氨双唑钠等应用于放疗临床治疗。然而，其对肿瘤的选择性不强、神经毒性、且缺乏肿瘤成像功能等缺点限制了临床广泛使用，因此，迫切需要研发安全、高效的新型放疗增敏剂。研究发现，光动力治疗（PDT）和光热治疗（PTT）可通过促进活性氧自由基（ROS）生成、增强血管通透性、改善乏氧、降低组织间液压、恢复生理pH值等多种机制增加RT抗肿瘤疗效。显然，研究一种兼具肿瘤靶向性和PDT/PTT效应，且有肿瘤成像功能的新型肿瘤增敏分子，将推动放疗/光动力/光热多模态抗肿瘤模式的形成。基于此，本研究设计并合成一个新型放射增敏分子（IR-83），该分子具有乏氧和线粒体双重肿瘤靶向性、放疗增敏效应、PDT/PTT 效应，且可近红外和光声双模态成像，指导生物效应的适时评价和疗效判定，实现PDT/PTT/RT多模态协同抗肿瘤治疗。 材料与方法：①以硝基咪唑为起始原料，经过5步取代和缩合反应，在IR-783的结构基础上引入放疗增敏基团硝基咪唑和水溶性磺酸基团，合成了硝基咪唑官能化的不对称 IR-783 衍生物 IR-83，经核磁共振氢谱（1H-NMR）、核磁共振碳谱（13C-NMR）、高分辨质谱（HRMS）鉴定结构；近红外-紫外-可见光分光光度计和荧光光谱仪检测IR-83的光学特性。②采用小动物近红外成像系统验证IR-83的近红外荧光成像能力、肿瘤靶向性、体内生物分布以及代谢动力学特征；小动物全身3D光声成像系统评价IR-83光声成像能力；③采用CCK-8法和Calcein AM/PI染色法评价IR-8的细胞毒性、光毒性；激光共聚焦显微镜和流式细胞仪评估其细胞摄入以及乏氧靶向性；SOSG荧光探针检测激光照射后IR-83溶液中单线态氧的生成；近红外热成像仪和温度计记录激光照射后溶液和肿瘤部位温度变化曲线，并根据水和IR-83的升温和降温曲线计算IR-83光热转换效率；④EdU、克隆形成实验、流式细胞仪检测不同组细胞增殖能力、克隆形成能力、细胞凋亡情况，生存曲线拟合观测放疗增敏效应；中性彗星电泳实验和免疫荧光检测细胞DNA双链断裂损伤情况；Western blotting检测凋亡相关基因表达；划痕实验和Transwell检测细胞迁移和侵袭能力变化。荷瘤小鼠随机分成不同治疗组，每 3 天检测一次肿瘤大小和小鼠体重变化，治疗结束后观察肺转移结节形成情况，IHC和TUNEL检测细胞相关蛋白表达以及细胞凋亡情况；⑤激光共聚焦显微镜和透射电镜观察IR-83线粒体共定位、形态和结构变化；JC-1和DCFH-DA荧光探针检测线粒体膜电位和ROS生存； 结果：①IR-83的设计、合成、表征：成功将硝基咪唑和磺酸基团引入IR-783骨架合成IR-83，经 1H-NMR、13C-NMR、HRMS鉴定结构正确；IR-83的最大吸收和发射波长均在近红外光谱区（700-900 nm），且在不同溶剂中斯托克位移值大于20 nm，作为近红外荧光探针具有较高的灵敏度；②肿瘤靶向显影成像：体内外实验表明IR-83具有良好的近红外成像和光声成像能力，且具有肿瘤选择性，区分肿瘤和周围正常组织。③IR-83的PDT/PTT效应：IR-83在LLC细胞摄入6 h就达到饱和，且在细胞乏氧的条件下摄入提高1-1.5倍；IR-83溶液在激光照射后生成大量的单线态氧，较对照组增加4倍；IR-83温度可升高至54 ℃（Δ T = 29 ℃），肿瘤部位温度迅速升高至约60 ℃（Δ T = 25 ℃）,光热转换效率高达54.1 %；CCK-8和Calcein AM/PI染色结果显示IR-83 + Laser处理后细胞活力较IR-83组明显下降（49 % vs 98 %）。④PDT/PTT放疗增敏：与单纯RT组相比，PDT/PTT/RT组细胞增殖、克隆形成（生存分数：0.073 vs 0.185）、侵袭转移、血管生成能力明显降低（P ＜ 0.01），而细胞凋亡（62 % vs 12.46 %）和DNA损伤明显增高（尾部DNA：65.7 % vs 17.2 %，γH2AX灶点数：36 .0 vs 15.3）（P ＜ 0.01），PDT/PTT的放射增敏比为1.33；PDT/PTT/RT联合治疗使肿瘤生长延缓甚至完全消融，抑制肿瘤的复发和转移，延长荷瘤小鼠的生存期（＞ 45天）；此外，该治疗模式具有良好的生物安全性，治疗期间各组小鼠血常规、肝肾功参数、脏器Hamp;E染色均无异常；⑤协同抗肿瘤机制研究：IR-83进入细胞后可定位至线粒体（PCC ＞ 0.95），在激光照射后在线粒体产生大量的ROS和热量，破坏线粒体形态和功能、诱导线粒体碎片化、线粒体膜电位减低。与RT组相比，PDT/PTT/RT组细胞内ATP水平降低（64.6 vs 1087.3 nmol/mg）；此外，其还可降低细胞内GSH含量（45.6 % vs 93.2 %）和增加NADP+/NADPH比值（1.94 vs 0.95），抑制Nrf2-HO-1介导的抗氧化信号通路，诱导细胞氧化应激损伤。 结论：①成功合成具有线粒体靶向、乏氧肿瘤蓄积、近红外和光声成像、PDT/PTT效应的新型放射增敏剂IR-83。②通过IR-83实现PDT/PTT/RT多模态治疗，可有效抑制肿瘤生长和转移，优于单纯放疗或光疗，且具有良好的生物安全性；③IR-83 协同抗癌机制与诱导线粒体损伤、氧化还原失衡、抑制氧化磷酸化有关。
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