摘要
超分辨定位成像利用荧光分子的闪烁特性和高精度的单分子定位实现了纳米级的空间分辨率。在此基础上升级而来的多视场超分辨拼接成像技术，可以有效解决高空间分辨率与大成像面积之间的矛盾，为细胞功能多尺度可视化提供强有力的工具。由于重建一幅超分辨图像要采集成千上万帧荧光图像，超分辨定位成像过程通常需要持续几分钟甚至更长的时间。在这个过程中，样品漂移可能会达到几百纳米，造成成像质量的显著下降。而对多视场超分辨拼接成像而言，除了单视场成像中的样品漂移，还需要考虑视场移动导致的离焦。在过去的十多年里，研究人员发展了多种方法来解决样品的漂移问题。然而，这些漂移校正方法在校正效果和易用性方面存在诸多不足，严重影响成像质量，增加实验难度，从而降低了超分辨定位成像技术的实用性。针对上述问题，本文研究了漂移校正精度对成像质量的影响，明确了超分辨定位成像对漂移校正精度的要求。然后，分别针对单视场超分辨定位成像和多视场超分辨拼接成像的场景，提出了合适的漂移校正解决方案。本论文主要内容如下： （1）为了指导漂移校正方法的选择，定量评估了漂移校正精度对超分辨定位成像质量的影响。结合微管的仿真数据和荧光小球成像实验，综合分析了漂移校正精度对成像质量的影响，提出并利用相对定位精度来定量评估这些影响。最后，证实漂移校正精度小于定位精度一半时，能够保证较好的成像质量。这一结论可用于指导漂移校正方法的选择，达到兼顾成像质量和实验难度的目的。 （2）针对典型的单视场超分辨定位成像的场景，发展了一种基于差分相衬成像的新型漂移校正方法。该方法利用差分相衬成像获取样品结构的高对比度图像，进而实现准确的漂移量估计。该方法具有较高的易用性，因为对应的光学系统简单稳定且无需额外的样品制备。实验结果表明该方法可实现三维方向~5 nm的校正精度，能够满足大部分超分辨成像实验的漂移校正要求。而且，该方法在应用于不同结构时均表现出良好的校正性能，鲁棒性较高。因此，该方法保证成像质量的同时，降低了实验难度，提高了单视场超分辨定位成像技术的实用性。 （3）针对多视场超分辨拼接成像的场景，提出了漂移校正的联合解决方案。在多视场超分辨拼接成像中，研究人员除了需要解决单视场超分辨定位成像中的漂移校正，还需要解决视场移动时的自动寻焦。然而，基于差分相衬成像的方法在进行漂移校正之前需要手动定位成像焦面以及选择合适的区域，与自动化成像的需求相矛盾。为此，本文构建了漂移校正联合解决方案：将近红外探测与荧光分子信噪比最优化相结合实现高性能自动寻焦，将近红外探测与冗余互相关相组合校正单视场漂移。细胞成像实验证实该联合方案的寻焦效果明显优于目前基于近红外探测的寻焦方法，能够有效保证成像质量的均匀性。在此基础上，进行了细胞样品的多视场超分辨拼接成像，证实该联合方案能够有效解决样品漂移的问题，实现全自动大面积超分辨定位成像。 综上所述，本文针对超分辨定位成像中的两种典型场景，包括单视场超分辨定位成像和多视场超分辨拼接成像，发展了简单有效的漂移校正方法，提高了超分辨定位成像技术的适用范围。
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