摘要
中华鳖（Pelodiscus sinensis）是广泛分布的淡水养殖动物，具有食用和药用价值。雄性中华鳖与雌性中华鳖相比具有显著的生长优势。因此，培育“全雄鳖”是中华鳖育种的重要方向。RA（视黄酸）及其代谢的外部信号促使生殖细胞进入减数分裂，决定生殖细胞发育成卵母细胞或精子。RA的表达由RARs和RXRs形成的二聚体与RA反应元件（RAREs）结合调控。其中，RXRs 参与动物的性别调控和性别发育。RXRs 形成的同源或异源二聚体在脊椎动物的生长发育、新陈代谢等生理过程起到重要作用。本研究克隆了中华鳖的Rxrα和Rxrγ基因的cDNA序列并进行表达分析，构建了多克隆抗体并对其在性腺中的蛋白表达进行了定性和定位，运用siRNA技术，分析了Rxrγ基因在性腺分化过程中的功能作用。结果如下： （1）Rxrα和Rxrγ全序列克隆及进化分析 通过克隆获得，中华鳖Rxrα基因5''非编码区323bp，开放阅读框1392bp。获得Rxrγ基因的 cDNA 序列全长 2152bp，5'' 非编码区 665bp，3'' 非编码区 266bp，开放阅读框1221bp，共编码405个氨基酸。进化分析表明，不同物种的RXR和RAR各亚型聚在一起，表明RXR基因的亚型保守型较高。此外，中华鳖RXR和RAR基因与龟鳖类相似性最高，与鱼类相似性最低，这与进化结果一致。对Rxrγ基因进行结构域可视化表明， Rxrγ基因包括NR-LBD-RXR-like、NR-DBD-RXR和Nuc-recep-AF1，它们都是典型核受体家族的保守结构域。 （2）RXRα和RXRγ表达规律及时空定位 实时荧光定量PCR结果表明，Rxrα和Rxrγ在中华鳖胚胎和成体的雌性性腺组织中都高度特异性表达。随后构建RXRα和RXRγ重组表达质粒，获得融合蛋白，使用实验小鼠进行免疫作用，得到目的基因的抗体血清。ELISA法检测RXRα效价为8.1×105， RXRγ效价为2.7×104，表明抗体可用于下一步的实验。Western Blot实验结果可知RXRα和 RXRγ 的蛋白同样在卵巢组织中表达量最高。免疫组织化学分析表明 RXRα、RXRγ蛋白在精巢中有明显的阳性信号。RXRα蛋白在卵巢的滤泡细胞、间质细胞中表达；RXRγ在卵巢的间质细胞中表达。这些研究结果表明RXRs在中华鳖雌性性腺中特异表达，并可能参与中华鳖性腺发育。 （3）Rxrγ功能分析 向中华鳖胚胎注射 Rxrγ 基因的 siRNA。定量结果和 WB 结果表明，Rxrγ 基因在mRNA和蛋白水平表达显著降低。HE染色结果显示精巢和卵巢的结构都呈现雄性化特征。精巢支持细胞数目显著增加；卵巢皮质区退化，并呈现精巢的结构特征。Rxrγ敲降后，雌性相关基因（Cyp19a1、Foxl2、Esr）的表达显著降低，雄性相关基因（Star、Sox9、Dmrt1）表达升高。来曲唑和雌激素受体拮抗剂处理后，Rxrγ基因在雄性成鳖睾丸中的表达量显著增加。结果表明，Rxrγ参与中华鳖性腺分化和发育过程，并且可能承担重要的功能作用。
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