摘要
夏枯草为唇形科植物夏枯草PrunellavulgarisL.的干燥果穗，在临床和大健康领域均有广泛应用。随着大健康产业的快速发展，市场对夏枯草的需求量大幅度增长，目前已在河南确山、湖北蕲春和江西新余等地开展大规模种植。作为大规模种植的中药材品种，夏枯草果穗的采收费工费时，成为制约其产业发展的重要难题。此外，从夏枯草植株不同器官（茎叶和果穗）的生物量看，茎叶生物量远远大于果穗，在果穗采收过程中大量的茎叶资源被丢弃，造成严重的资源浪费。因此，明确夏枯草茎叶与果穗化学组成的异同性，挖掘其茎叶的利用价值，对于资源的综合利用具有重要意义。再者，夏枯草在采后处理和贮藏过程中种子易脱落，产生大量的种子下脚料作为废弃物丟弃，深入挖掘夏枯草种子的利用价值，锁定其研发方向，可为夏枯草废弃资源的综合利用提供参考。 因此，本论文在广泛的国内外文献调研基础上，赴夏枯草两大主产区（河南确山和江西新余）收集夏枯草果穗、茎、叶和种子4个部位共32批样品以及不同成熟度的全株样品。在对4个部位进行定性定量分析和抗氧化活性研究的基础上，采用脂多糖（LPS)诱导小鼠巨噬细胞（RAW264.7)释放一氧化氮（NO)模型评价果穗和茎叶的水提物以及不同部位的抗炎活性，明确茎叶的抗炎作用及其活性成分。为明确夏枯草种子的利用价值，从外观性状、膨胀度和化学组成（酚酸、脂肪酸和挥发油）等方面系统比较夏枯草种子与市售奇亚籽和兰香子的差异性，探讨夏枯草种子用于功能食品开发的可行性。主要研究结果和结论如下： 1、夏枯草不同部位化学组成和抗氧化活性研究 采用超高效液相色谱串联四极杆飞行时间质谱（UPLC-QTOF-MS/MS)检测果穗、茎、叶和种子4个部位的化学成分，共检测到117个成分，有84个首次检出，共鉴定出87个化合物，包括32个酚酸，45个三萜皂苷，其中存在连接4~6个单糖的潜在新三萜皂苷；采用各种柱色谱技术和波谱解析手段对其中主要的目标三萜皂苷进行分离鉴定，获得了2个新化合物，验证了质谱鉴定的结果。对32批样品的质谱数据进行多元统计分析，发现茎、叶、果穗和种子样品各自聚为一类，但总体上，茎、叶和果穗距离更近，与种子区分明显，主要的差异性成分为种子中高含量的异迷迭香酸苷。考虑到种子在果穗中的重量占比（24.6%)，推测果穗的化学成分是茎叶和种子的综合体现。 为了定量比较夏枯草不同部位酚酸类成分的差异，建立了超高效液相色谱(UPLC)同步测定6种酚酸（丹参素、原儿茶酸、原儿茶醛、咖啡酸、异迷迭香酸苷和迷迭香酸）含量的分析方法，结果表明丹参素、原儿茶酸、原儿茶醛、咖啡酸、异迷迭香酸苷和迷迭香酸在0.255?258、0.147?37.4、0.0320?32.6、0.143?145、0.249~254和0.510~520μg·mL-1范围内线性关系良好，精密度、重复性和稳定性均符合定量分析要求，加样回收率分别为97.9%、89.8%、94.7%.95.9%.94.2%和96.2%。茎、叶、果穗和种子中丹参素、原儿茶酸、原儿茶醛、咖啡酸、异迷迭香酸苷和迷迭香酸的含量依次为0.00716%～0.550%、0.00249%～0.0255%、0.00114%?0.00831%、0.00182%?0.159%、0.00340%～0.339%和0.203%?1.51%。对含量结果进行统计学分析，发现种子中除异迷迭香酸苷外，其他酚酸低于果穗，果穗除异迷迭香酸苷含量高于茎、叶外，其他酚酸含量与茎无显著性差异，原儿茶醛和咖啡酸低于叶。采用DPPH自由基清除法检测4个部位32批样品的抗氧化活性，结果表明茎、叶的抗氧化活性与果穗无显著性差异，三者均显著高于种子。将各样品的抗氧化活性与酚酸含量进行相关性分析，结果表明与丹参素、原儿茶醛、咖啡酸和迷迭香酸正相关，与异迷迭香酸苷负相关，提示丹参素、原儿茶醛、咖啡酸和迷迭香酸是夏枯草发挥抗氧化活性的重要物质。 2、夏枯草果穗和茎叶提取物的制备及其抗炎活性评价 夏枯草果穗具有抗炎活性，临床常用于治疗甲状腺炎和乳腺炎等。为了明确茎叶的利用价值，本研究比较了果穗和茎叶的体外抗炎作用，并对活性部位进行筛选。果穗和茎叶采用水提取，浓缩干燥得S-ZTW和JY-ZTW,水提物经大孔吸附树脂粗分为S-WXF、S-S、S-30%、S-50%、S-70%.S-无水、JY-WXF、JY-S、JY-30%、JY-50%、JY-70%、JY-无水，采用UPLC-QTOF-MS/MS对各部位进行成分表征，采用UPLC和高氯酸比色法分别测定各部位中酚酸和总皂苷含量，结果发现S-30%和JY-30%主要为以迷迭香酸、脱氢丹酚酸B或其异构体为主的酚酸类成分，迷迭香酸含量分别为0.113%和0.0574%，50%乙醇、70%乙醇和无水乙醇洗脱部位主要为三萜类成分，S-50%、S-70%和S-无水总皂苷含量分别为30.0%、35.2%和37.1%，JY-50%、JY-70%和JY-无水总皂苷含量分别为32.2%、50.8%和40.3%。采用LPS诱导的RAW264.7细胞释放一氧化氮（NO)模型，对水提物及各部位进行抗炎活性评价，发现S-ZTW在100μg·mL-1具有显著抑制NO释放作用，JY-ZTW在20μg·mI-1具有相似的作用趋势，但茎叶与果穗在200μg·mL-1时抗炎活性无显著性差异；各部位进一步的活性比较表明，茎叶和果穗的30%乙醇、50%乙醇、70%乙醇和无水乙醇部位均具有显著抑制NO释放作用，S-30%、S-50%、S-70%和S-无水部位的半最大效应浓度（EC50)分别为82.7、85.4、66.646.0μg·mL-1,JY-30%、JY-50%、JY-70%和JY-无水部位EC50分别为135、93.8、141和101μg·ml-1。分别选择果穗和茎叶活性最好的部位（S-无水和JY-50%)以及三萜皂苷化合物1，采用酶联免疫吸附测定法（Elisa)测定LPS诱导的RAW264.7细胞炎症因子白细胞介素-1β(IL-1β)和白细胞介素-6(IL-6)水平，结果发现在93.8μg·mL-1浓度下，JY-50%部位能够有效抑制IL-6产生，S-无水和JY-50%部位分别在92.0μg·mL-1和187μg·mL-1浓度下能有效抑制炎症因子IL-1β，化合物1在94.0μg·mL-1浓度下，能有效抑制IL-lβ和IL-6。综上，茎叶提取物在相同给药浓度下抗炎活性与果穗无显著性差异，进一步进行成分富集以后，茎叶各部位抗炎作用略低于果穗，其中酚酸和三萜皂苷对其整体抗炎作用均有贡献。 3、夏枯草种子开发利用的探索研究 夏枯草种子含有丰富的异迷迭香酸苷和迷迭香酸，迷迭香酸提取物作为天然的抗氧化剂，已在食品、医药和化妆品等领域广泛使用，从迷迭香中制备的提取物也被作为食品添加剂。为了充分挖掘夏枯草种子的利用价值，实现废弃资源的综合利用，釆用大孔吸附树脂富集夏枯草种子的异迷迭香酸苷和迷迭香酸，制备夏枯草种子酚酸提取物，结果发现30%乙醇部位中异迷迭香酸苷和迷迭香酸含量分别为25.8%和6.94%,50%乙醇部位迷迭香酸含量为15.3%。后续可考虑经水除杂后直接用50%乙醇洗脱，兼顾两种酚酸，以探究夏枯草种子酚酸提取物用于食品添加剂开发的可行性。夏枯草种子能够吸水膨胀，这种特性与市售代餐品奇亚籽和兰香子相似，为探究种子用于功能食品开发的可行性，对夏枯草种子进行性状、膨胀度和化学组成（酚酸、脂肪酸和挥发油）研究，并与市售奇亚籽和兰香子进行比较，结果表明夏枯草种子比奇亚籽和兰香子略小，种皮颜色明显不同；夏枯草种子膨胀度为17.4，略低于奇亚籽（膨胀度25.2)和兰香子（膨胀度35.6)，夏枯草种子中酚酸类成分以异迷迭香酸苷和迷迭香酸为主，含量分别为0.579%和0.392%，均高于奇亚籽和兰香子；夏枯草种子正己烷提取率为18.3%，主要以棕榈酸、油酸、硬脂酸、亚油酸和α-亚麻酸为主，种子中挥发油含量极低。为了准确测定夏枯草种子中5种主要脂肪酸的含量，建立了以正十五烷为内标的气相色谱-质谱(GC-MS)检测方法，并同步测定夏枯草种子、奇亚籽和兰香子以及苦参子油和8种市售植物油（亚麻籽油、核桃油、芝麻油、山茶油、葡萄籽油、紫苏籽油、橄榄油和杜仲籽油）中5种成分的含量，结果表明棕榈酸、油酸、硬脂酸、亚油酸和α-亚麻酸在0.0250～0.800、0.128～4.05、0.0127～0.402、0.144～4.57和0.217～6.90g·L-1线性关系良好，方法学验证符合要求。夏枯草种子油中不饱和脂肪酸丰富，其中α-亚麻酸含量达到50.0%，略低于奇亚籽（57.2%),与兰香子(50.0%)相当，远高于苦参子油、杜仲籽油和亚麻籽油。综上所述，夏枯草种子吸水膨胀性好，酚酸和不饱和脂肪酸含量丰富，特别是具有高含量的α-亚麻酸，可对其进行功能食品开发，从而实现夏枯草废弃资源的综合利用。
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