摘要
镉(Cd)是对植物产生严重毒害的重金属之一，外源24-表油菜素内酯(24-epibrassinolide，eBL)的应用可有效缓解重金属对植物造成的胁迫。目前的研究主要以整个植株或植物叶片为材料，从生理生化应答机制上揭示eBL对植物重金属耐受性的调控作用，对重金属胁迫下eBL对植物根、茎和叶的差异调控知之甚少。此外，从转录水平揭示eBL如何通过调控基因功能谱和表达谱的变化来提高植物重金属耐受性的研究资料还比较缺乏。本研究以绿豆幼苗(VignaradiataL.)为材料，研究eBL对Cd胁迫下植物根、茎和叶矿质元素吸收及生理生化指标的影响，并利用RNA-Seq技术揭示eBL缓解植物Cd胁迫的分子机制。主要结果如下： 1.eBL对Cd胁迫下绿豆幼苗生长及矿质元素吸收的影响。100μMCdCl2显著抑制植物生长，0.05μMeBL处理缓解了Cd胁迫对植物的生长抑制，使Cd胁迫下植物的主根长、侧根数、地上鲜重和根鲜重分别提高了19.4%、3.9%、4.1%和7.7%。与对照相比，单独eBL处理使处理后期根和叶K含量分别提高了19.9%和15.0%，茎Mg含量提高了4.0%，茎和叶Ca含量分别提高了20.4%和19.3%。单独eBL处理使所有处理时间点根、茎和叶Cu含量分别显著增加了31.7%、68.9%和62.0%，茎K含量显著提高了13.2%，茎和叶Zn含量分别显著提高了56.8%和26.8%。外源eBL的施加使根、茎和叶中Cd胁迫降低的Cu含量增加，使根中Cd胁迫降低的Mg含量增加，且eBL部分恢复Cd胁迫引起的植物根、茎和叶K、Zn含量的变化。eBL处理使根、茎和叶中Cd积累量分别降低了15.2%、53.6%和78.6%。植物对矿质元素吸收量的增加与Cd积累量的降低有关。结果表明，eBL可调控Cd胁迫下绿豆幼苗对矿质元素的吸收，显著降低根、茎和叶中Cd的积累量，进而缓解绿豆幼苗Cd胁迫。 2.eBL对Cd胁迫下绿豆幼苗根、茎和叶生理生化指标的影响。与对照相比，单独eBL处理对根、茎和叶抗氧化酶活性、谷胱甘肽(glutathione，GSH)和多酚(polyphenol)含量无明显影响，但使根、茎和叶脯氨酸(proline，Pro)含量分别显著提高了54.9%、39.9%和94.4%，叶丙二醛(malondialdehyde，MDA)含量提高了69.0%。eBL的施加使根中Cd胁迫提高的抗坏血酸过氧化物酶(ascorbateperoxidase，APX)和超氧化物歧化酶(superoxidedismutase，SOD)活性降低，使根中Cd胁迫升高的polyphenol、Pro和GSH水平降低。此外，eBL施加降低了Cd胁迫下植物叶中的叶绿素含量，使根、茎和叶MDA水平降低。eBL明显恢复了叶中Cd胁迫降低的过氧化氢酶(catalase，CAT)活性和polyphenol含量。结果表明，外源eBL的应用可有效维持Cd胁迫下绿豆幼苗细胞的氧化还原稳态，通过调控抗氧化系统活性来减轻Cd胁迫引起的植物细胞膜脂过氧化，从而缓解Cd毒害。eBL介导植物根、茎和叶细胞不同的生理生化反应对Cd胁迫产生差异应答。此外，本研究对比分析了Cd胁迫下，eBL和脱落酸(abscisicacid，ABA)对植物生化指标的调控作用，发现ABA和eBL在缓解植物Cd胁迫时，对植物根、茎和叶生化指标影响相似，表明ABA和eBL通过一些共同的下游调控途径提高植物重金属耐受性。 3.eBL对Cd胁迫下绿豆幼苗根、茎和叶基因表达的影响。对Cd处理和eBL+Cd处理的根、茎和叶进行转录组分析。在根中共有507个差异表达基因(differentiallyexpressedgenes，DEGs)，其中上调基因有144个，下调基因有363个。茎中共有825个DEGs，包括277个上调基因和548个下调基因。叶中共有1379个DEGs，有396个基因上调，983个基因下调。根据GO功能和KEGGpathway富集结果可知，根中内质网蛋白加工及次级代谢物生物合成通路基因在eBL调控下显著富集，其中与黄酮类物质相关的基因显著上调，热激蛋白编码基因显著下调，表明这些基因在eBL调控植物Cd耐受性中发挥重要作用。茎中基因显著富集在植物昼夜节律和次级代谢物生物合成通路中，其中参与植物昼夜节律代谢通路的基因显著性上调，类苯基丙烷生物合成代谢通路是响应eBL调控的主要次级代谢途径。叶中与蛋白质合成和GSH代谢途径有关的基因显著上调，与植物激素信号转导、MAPK信号网络以及钙信号有关的基因显著下调，表明eBL调控蛋白质合成相关基因、解毒基因及信号转导途径相关基因的表达响应Cd胁迫。以上结果表明，eBL差异调控Cd胁迫下绿豆幼苗根、茎和叶功能基因及生物代谢途径基因的表达，缓解Cd胁迫。 利用qRT-PCR技术对光调蛋白编码基因LIR，异黄酮2''-羟化酶编码基因CYP81E，谷胱甘肽-S-转移酶F9编码基因GSTF9，1-氨基环丙烷-1-羧酸氧化酶编码基因ACO，70kDa热激蛋白编码基因HSP70，查尔酮-二氢黄酮异构酶编码基因CHI，查尔酮合酶编码基因CHS和谷胱甘肽-S-转移酶编码基因GST共8个基因进行相对定量分析。结果显示，qRT-PCR与RNA-Seq数据具有较好的相关性(R2=0.8497，Plt;0.01)，表明测序结果可信。
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