摘要
细胞分裂素(cytokinin,CK)是一类具有多重作用的植物激素，能够促进植物细胞分裂分化、提高籽粒产量、调控非生物胁迫等。细胞分裂素氧化/脱氢酶(cytokininoxidase/dehydrogenase,CKX)是唯一不可逆降解细胞分裂素的酶。普通小麦(TriticumaestivumL.)属于禾本科植物，是世界上三大粮食作物之一，为人类提供了约20%的蛋白质和热量。因此，研究TaCKX基因的功能对培育优质、高产的小麦品种具有重要意义。 本研究鉴定了部分济麦22号(JM22)小麦M2代TaCKX1突变株系，通过分析TaCKX1突变株系的株高、千粒重及不同时期TaCKX1基因相对表达量，初步研究了TaCKX1基因突变的表型效应。通过对小麦原生质体制备及瞬时转化体系的优化，检测了实验室前期构建的靶向TaCKX1的CRISPR/Cas9基因编辑载体活性。在优化小麦遗传转化体系的基础上，获得了pTaCKX1-g1转基因阳性植株，为进一步研究TaCKX1基因的功能奠定了材料基础。主要研究结果如下： 1.TaCKX1突变株系的鉴定及其生理功能和基因表达分析 为研究TaCKX1基因的功能，共获得了6个M2代TaCKX1突变株系(JM5、JM23、JM52、JM98、JM138和JM274)。克隆测序验证表明它们均存在C→T或G→A的EMS诱变类型的单碱基突变。对鉴定成功的突变株系进行株高、千粒重和TaCKX1基因表达分析发现：JM274的株高及千粒重均显著高于其他株系，且花期与成熟期的TaCKX1基因表达量低于其他株系，表明TaCKX1基因是细胞分裂素的负调控因子，与小麦产量密切相关。 2.济麦22号原生质体制备及瞬时表达体系的优化与TaCKX1基因编辑载体活性检测 为了检测TaCKX1基因编辑载体活性，对小麦原生质体的制备和转化条件进行了优化。本研究通过设计正交实验确定了济麦22号小麦原生质体制备的最佳条件。结果发现酶解液中纤维素酶浓度为1.5%、离析酶浓度为0.5%、甘露醇浓度为0.8mol/L，25℃黑暗条件下酶解3h得到的原生质体完整性最好，原生质体产量达6.97×106个/mL，活性达93.99%，均高于其他组合。在原生质体浓度为2×105个/mL、PEG-4000浓度为25%、质粒浓度为1μg/μL及转化时间为20min的条件下，利用PEG-Ca2+介导法将表达绿色荧光蛋白的重组质粒pAN580载体瞬时转化原生质体后，转化效率达到65.22%。将TaCKX1基因编辑载体转入原生质体后，发现有一个具有编辑活性，将其命名为pTaCKX1-g1。 3.小麦遗传转化体系的优化及pTaCKX1-g1转基因阳性植株鉴定 利用农杆菌介导法将pTaCKX1-g1载体转入小麦幼胚，通过诱导、分化愈伤组织等步骤获得38株转基因植株，再通过提取植株DNA、PCR扩增、酶切、特异引物扩增、酶切等实验步骤，在A亚基因组鉴定出2个pTaCKX1-g1转基因阳性植株，在B亚基因组鉴定出1个pTaCKX1-g1转基因阳性植株，为后续进一步研究TaCKX1基因功能奠定了材料基础。
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