摘要
中国是全球食管癌高发区域之一，2020年世界卫生组织国际癌症研究机构（IARC）最新统计数据显示，食管癌在我国的发病及死亡人数均占全球病例的一半以上。我国90%以上食管癌病理表现为鳞状上皮细胞癌（Esophagealsquamouscellcarcinoma,ESCC），总体五年生存率为15~25%，由于其高发态势和独有的病理分型，食管癌素有“中国特色肿瘤”之称。尽管近年来食管癌的治疗在手术切除肿瘤、化疗、放疗和免疫治疗等方面取得了进展，但仍然是一种死亡率很高的恶性肿瘤。随着中药抗肿瘤的作用逐渐被发现，中药已被广泛用于各种类型肿瘤的治疗过程中，多数情况下与抗肿瘤药物一起使用，被用于辅助抗肿瘤治疗、提高患者生存质量以及改善化疗药物及放疗相关不良反应，被认为有巨大的潜力。猫爪草是原产自我国河南的一种中药，临床上多用于治疗淋巴结结核、肺结核、咽喉炎、疟疾等，近年来也被发现有较好的抗肿瘤效果。但是中药由于成分复杂，以多成分、多靶点的特点作用于人体，所以其药理机制难以明确。而网络药理学这种研究方式则是通过系统角度和分子水平来探究中药与人体和疾病之间的联系，可以使中药的治疗更具有系统性和客观性。所以本课题主要通过网络药理学和实验验证的方法来探索猫爪草在食管鳞癌中的抗肿瘤作用机制。 研究目的 猫爪草有化痰散结，解毒消肿功效，当前研究表明猫爪草有广谱的抗肿瘤效果，对肺癌、乳腺癌、肝癌及淋巴瘤等均有一定的疗效，常用猫爪草与鳖甲、莪术、冬凌草组成“甲术二草汤”来治疗肝癌、卵巢癌和乳腺癌，有养阴软坚的功效。现阶段对猫爪草抗肿瘤作用机制的研究大部分局限于体外细胞研究水平，而且采用西医单靶标、单成分的研究思路来研究中药，很难体现中药的系统性，不能科学解释其作用机理，如能结合网络药理学分析并从分子机制的角度进行验证，将极大提升证据等级，为临床推广应用奠定基础。因此本研究将通过网络药理学以及实验验证来探究猫爪草的有效抗肿瘤成分及其对食管鳞癌的抗肿瘤治疗药理机制。 研究方法 1.不同猫爪草提取物对人食管鳞癌细胞的增殖抑制作用 先通过预实验选取合适的乙醇浓度，再采用回流提取法及系统溶剂法萃取分离猫爪草，获得猫爪草石油醚萃取部位（RTP）、猫爪草乙酸乙酯萃取部位（RTE）、猫爪草正丁醇萃取部位（RTB）。再应用MTT实验了解RTB、RTE和RTP分别对食管鳞癌细胞TE-1、TE-13、Eca-109的增殖抑制作用，计算每种药物作用于不同细胞系的IC50值，并将结果进行比较及统计学分析，得到抑制作用最强的萃取部位。 2.检索猫爪草有效成分并通过网络药理学预测及探讨治疗食管鳞癌的分子机制 通过文献检索收集猫爪草药物成分，在Pubchem、CAS网站进行成分验证和转化，并收集Pubchem、TCMSP、SEA、TargetNet、PharmMapper、SwissTargetPrediction数据库中化学成分相关作用靶点，在Genecards、OMIM数据库中，以“esophagealsquamouscellcarcinoma”为关键词检索食管鳞癌相关靶点，筛选出猫爪草与食管鳞癌共同靶点作为研究靶点，将共同靶点导入STRING数据库中构建PPI网络图，使用软件Cytoscape3.2.7构建活性成分-靶点网络图，结合上述2个网络图中数据分析获得猫爪草作用于食管鳞癌的核心靶点，应用DAVID数据库对核心靶点进行GO富集分析和KEGG信号通路分析，最后上传至微生信网站生成可视化结果。 3.验证猫爪草乙酸乙酯萃取部位抑制食管鳞癌细胞增殖的分子机制 通过WesternBlot蛋白印迹实验，对网络药理分析结果中的主要核心靶点、涉及通路及生物过程进行验证，检测猫爪草对食管鳞癌细胞增殖抑制过程中可能调控的信号通路和相关蛋白。 研究结果 1.用60%和95%两种浓度的乙醇溶液分别进行回流提取，进行预实验，得到猫爪草60%乙醇提取物和猫爪草95%乙醇提取物，将两种乙醇浓度提取物用DMSO溶解定量后进行MTT实验，比较二者对食管鳞癌细胞的抑制作用，结果显示猫爪草的95%乙醇溶液提取物抑制作用较好，但二者之间的差异无统计学差异。结合预实验结果及既往研究数据，决定选用95%乙醇用于猫爪草的提取。用95%乙醇提取猫爪草并进行有机溶剂萃取纯化后得猫爪草石油醚萃取部位（RTP）、猫爪草乙酸乙酯萃取部位（RTE）、猫爪草正丁醇萃取部位（RTB），将不同溶剂萃取物溶解定量后对食管鳞癌细胞TE-1、TE-13、Eca-109进行MTT实验，结果显示RTB对食管鳞癌细胞均无明显增殖抑制作用，RTE和RTP对TE-1、TE-13、Eca-109食管鳞癌细胞均有较明显的增殖抑制作用，其中对Eca-109细胞株的抑制作用最显著，RTE和RTP两种药物之间对于食管鳞癌细胞的增殖抑制作用无统计学差异。 2.结合猫爪草各提取部位的MTT结果及既往文献研究，确定选用猫爪草乙酸乙酯萃取物（RTE）为本次研究的主要对象，文献检索收集RTE中化合成分共32种，在数据库中检索获得化合成分相关靶点共472个。食管鳞癌相关靶点共4838个，食管鳞癌与RTE重合靶点共281个，筛选后获得RTE作用于食管鳞癌的核心靶点共14个，分别为HSP90AA1、MAPK1、RELA、ESR1、CASP3、PPARG、AR、PTGS2、CDK2、F2、MAPK10、ESR2、PGR、MMP3。GO富集分析显示相关生物过程52个，分子功能9个、细胞组分30个，其中RTE所调控的核心靶点主要涉及信号转导、细胞因子介导的信号通路和药物应答等生物过程。KEGG信号通路有36条，主要参与癌症通路、TNF信号通路、MAPK信号通路、PI3K/Akt通路、NOD样受体信号通路等。 3.选择TE-13和Eca-109细胞进行WesternBlot实验，将IC50值浓度的RTE作用于TE-13和ECa-109细胞株48h后，与对照组进行比较，对蛋白印迹条带进行分析测定，结果显示RTE主要通过下调MEK/ERK和PI3K/Akt通路，以及抑制HSP90和c-Myc的表达，从而发挥抑制食管鳞癌细胞增殖的功能。
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