摘要
杨树叶枯病是由链格孢菌（Alternariaalternata）引起的叶部病害，是我国较为严重的林木病害之一，可导致杨树叶片大量提前脱落，影响树木的生长发育和木材品质。揭示链格孢菌致病相关基因对于阐明杨树叶枯病致病机制和杨树叶枯病防治具有重要意义。本研究在前期从患叶枯病小黑杨叶片分离病原链格孢菌基础上，进行形态学和分子生物学鉴定；通过转录组测序，鉴定链格孢菌在过氧化氢胁迫下的差异表达基因，主要结果如下： ①从患叶枯病的小黑杨叶片分离获得杨树叶枯病病原菌，经形态鉴定确认该菌株属于链格孢菌Alternariaalternata；经科赫法则检验，证明链格孢菌Alternariaalternata能够侵染小黑杨叶片，使叶片产生病斑甚至坏死；通过PCR克隆ITS序列，多序列比对发现其与草莓腐烂病病原真菌、黄瓜腐烂病病原真菌、番茄腐烂病病原真菌高度相似。通过构建系统进化树，发现杨树叶枯病病原真菌与苍术黑斑病的病原真菌Alternariatenuissima亲缘关系最近。 ②利用Nanopore测序技术平台对Alternariaalternata基因组进行第三代测序，通过重复序列预测和编码蛋白基因预测，共获得13,063个基因。通过转录组测序，鉴定出724个杨树叶枯病病原菌Alternariaalternata应答H2O2胁迫的差异表达基因。获得625个功能注释编码蛋白的DEGs，其中196个上调表达，429个下调表达。GO富集分析及KEGG富集分析结果表明，DEGs主要参与生物过程、分子功能和细胞组分这三类生物学过程；合成抗生素通路富集的DEGs数目最多，但富集程度显著水平较低；而VB6、色氨酸、淀粉和蔗糖代谢以及赖氨酸生物合成等通路富集的DEGs数虽然不多，但富集显著水平较高。 ③通过Pfam数据库获取CAT、POD、SOD家族的保守结构域，使用hmmsearch搜索蛋白家族成员，通过序列比对及系统发育树构建进化分析不同蛋白家族亲缘关系。结果表明杨树叶枯病菌CAT、POD和SOD家族成员结构与来自玉米、拟南芥、水稻稻瘟病菌、酿酒酵母的蛋白质结构有许多相似之处。 ④通过差异表达基因分析，发现在22个CAT、POD和SOD基因中有11基因在过氧化氢胁迫下差异表达，而且在差异表达基因中45%基因表现为上调表达，55%基因表现为下调表达。杨树叶枯病菌中有12个毒素合成相关基因在过氧化氢胁迫下表达水平发生了极显著变化，其中有1个上调表达基因和11个下调表达基因。在过氧化氢胁迫条件下黑葡萄穗霉毒素合成相关基因较水处理对照组表达水平提高2.99倍；在11个下调表达基因中，有5个黄曲霉毒素合成相关基因、2个killer毒素亚单位合成相关基因，还有TES毒素合成、ζ毒素、链格孢毒素合成、胶质毒素生物合成蛋白等，这些基因表达水平下降幅度为2.7-13.6倍。 本研究通过分析杨树叶枯病病原菌应答过氧化氢胁迫下的基因差异表达，可为杨树叶枯病病原菌致病机理以及林木病害防治提供理论依据。
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