摘要
目的：本实验通过观察六味地黄丸对APP/PS1双转基因小鼠的行为学及胆碱能系统影响、TLR4/NF-κB信号转导途径的作用，以及通过体外细胞实验，观察六味地黄丸含药血清对Aβ诱导PC12细胞的TLR4/NF-κB信号转导途径的影响，进而探讨六味地黄丸对AD的治疗作用及机制，为六味地黄丸从肾论治AD和临床用药提供重要理论支持。材料与方法：3月龄雌性APP/PS1双转基因小鼠40只，相匹配的3月龄雌性野生型（WT）小鼠8只，体重（30±5）g。将40只APP/PS1双转基因小鼠随机分为5组，每组8只。按照人与小鼠体表面积等效剂量换算方法，得六味地黄丸低、中、高剂量（0.59，1.18，2.36g·kg-1·d-1，按生药量计，下同）组。西药布洛芬组用药量0.04g·kg-1·d-1，生理盐水混匀，按体积10mL·kg-1每日2次ig，正常组和APP/PS1模型组分别给予等体积生理盐水每日2次ig，以上各组连续治疗3个月。Morris水迷宫测定各组小鼠找到平台所需的时间（即潜伏期），在平台所在象限的停留时间，并计算此停留时间所占游泳总时间的百分比，记录穿越平台的次数。Morris水迷宫测定后，4%水合氯醛麻醉，经腹主动脉取血，分离血清后按照乙酰胆碱（Ach）、乙酰胆碱转移酶（ChAT）、乙酰胆碱酯酶（AchE）、TNF-α、IL-1βELISA试剂盒说明进行操作。腹主动脉取血后，小鼠牺牲，取材，切片。免疫组化检测Aβ、GFAP及NF-κB，Real-TimePCR检测小鼠海马TLR4、MyD88及NF-κBmRNA表达，Westernblot检测小鼠海马TLR4、MyD88及p-NF-κB蛋白表达。40只Wistar大鼠，自然采光，室温16-25℃。相对湿度60%的标准环境下，自由饮水进食，适应性喂养2-3d，随机分为两组，其中正常对照组20只，中药组20只。中药组给予生药质量浓度1.18g·kg-1·d-1的六味地黄丸粉末水溶液灌胃，10mL·kg-1日两次，正常对照组给予等体积的生理盐水。根据前期预实验结果，持续灌胃3d后，血药浓度（以六味地黄丸被吸收后大鼠血清中马钱苷含量计算）达到稳定，同时考虑实验时间及效率，选取连续灌胃5d后取血。第5d首次给药2小时左右，10%水合氯醛麻醉溶液腹腔麻醉，经腹主动脉采血，制备血清。大鼠肾上腺嗜铬瘤（PC12）细胞，高分化，将细胞按5×105个/mL密度接种到25cm2培养瓶内，每瓶加4mL培养基，分为正常对照组，模型组，10%六味地黄丸含药血清（根据前期预实验结果）治疗组，MyD88沉默组，VE组。37℃，5%CO2的孵育箱中培养24h，PBS冲洗2-3遍，换用无血清DMEM饥饿处理24小时，正常对照组，模型组，VE组换成含10%大鼠血清的DMEM培养基，VE组同时加入终浓度为20μg/mL的VE溶液，六味地黄丸含药血清组换用含终浓度10%的含药血清，各自预保护24小时后，除对照组外其他各组均加入终浓度为30μMAβ25-35，37℃、5%CO2培养箱内作用36小时，进行后续操作。转染前24h，PC12细胞计数，按5×105/孔接种到标准的24孔板中。高糖DMEM培养基培养（不含抗生素），细胞生长丰度达60%进行转染。每孔加入Lipofectamine20005μL+20μMsiRNA5μL。转染进行24小时后，将培养基更换为含10%胎牛血清的DMEM完全培养基。48小时后在荧光显微镜下观察siRNA荧光显色，确定转染效率。当细胞转染效率超过90%，收集细胞。将对照组，siRNA组，和阴性对照组的细胞分别用于Real-TimePCR检测MyD88mRNA和蛋白的表达状况，选出沉默效率最高的siRNA序列。测定各组细胞上清液中TNF-α和IL-1β含量。测定各组PC12细胞TLR4、MyD88及NF-κBmRNA，测定各组PC12细胞TLR4、MyD88及p-NF-κB蛋白。采用SPSS18.0统计软件，各组数据均用x-±s表示，组间的比较采用单因素方差分析，以P＜0.05为差异有统计学意义。 结果： 1六味地黄丸对APP/PS1双转基因小鼠行为学影响的实验研究 1.1六味地黄丸对各组小鼠Morris水迷宫定位航行实验的影响 在各组小鼠水迷宫定位航行实验中，随着训练时间和次数的增加，各组潜伏期有缩短趋势。其中，APP/PS1模型组与正常组相比在各时期潜伏期均延长，有显著性差异（P＜0.05）。六味地黄丸高剂量组和布洛芬组与APP/PS1模型组相比，潜伏期缩短，有显著性差异（P＜0.05）。六味地黄丸低剂量组与模型组相比，潜伏期缩短，在测试第5，6，7d有显著性差异（P＜0.05）。 1.2六味地黄丸对各组小鼠Morris水迷宫空间探索实验的影响 在各组水迷宫空间探索实验中，与正常组相比，APP/PS1模型组在平台所在象限停留时间，百分比，穿越平台次数均降低，有显著性差异（P＜0.05）。六味地黄丸低、中、高剂量组和布洛芬组与APP/PS1模型组相比，在平台所在象限停留时间，百分比，穿越平台次数均增高，有显著性差异（P＜0.05）。 1.3各组小鼠海马Ach、ChAT和AchE的含量 模型组与正常组相比，Ach及ChAT含量均降低，有显著性差异（P＜0.05）。六味地黄丸低、中、高剂量组和布洛芬组与APP/PS1模型组相比，Ach及ChAT含量均增高，有显著性差异（P＜0.05）。APP/PS1模型组AchE的含量较正常组及六味地黄丸低、中、高剂量组和布洛芬组略有增高，但无统计学差异（P＞0.05）。 2六味地黄丸对APP/PS1双转基因小鼠TLR4/NF-κB信号转导途径的影响 2.1免疫组化法检测Aβ、GFAP、NF-κB蛋白表达情况 正常对照组小鼠脑内未观察到Aβ沉积所形成的老年斑，而APP/PS1模型组海马中的老年斑（Aβ）的数量多，总面积大，经计算所得的积分光密度值高。六味地黄丸中、高剂量组和西药布洛芬组Aβ积分光密度值显著降低（Plt;0.01），老年斑数量减少，总面积降低。六味地黄丸中、高剂量组和西药布洛芬组星形胶质细胞活化状态明显减弱。APP/PS1模型组NF-κB蛋白表达显著增高（Plt;0.01），且观察到海马细胞核内呈高表达状态。 2.2各组小鼠血清TNF-α和IL-1β含量的比较 与正常对照组相比，APP/PS1模型组小鼠血清TNF-α和IL-1β含量增高（P＜0.05）。与APP/PS1模型组相比，六味地黄丸中、高剂量组和西药布洛芬组小鼠血清TNF-α和IL-1β含量降低（P＜0.05），而六味地黄丸低剂量组无统计学差异（P＞0.05）。 2.3各组小鼠海马TLR4、MyD88及NF-κBmRNA的表达情况 APP/PS1模型组小鼠海马TLR4、MyD88及NF-κBmRNA表达增高（P＜0.05）。与APP/PS1模型组相比，六味地黄丸中、高剂量组和西药布洛芬组小鼠海马TLR4、MyD88及NF-κBmRNA表达降低（P＜0.05）。 2.4各组小鼠海马TLR4、MyD88及p-NF-κB蛋白的表达情况 APP/PS1模型组小鼠海马TLR4、MyD88及NF-κB蛋白表达增高（P＜0.05）。与APP/PS1模型组相比，六味地黄丸中、高剂量组和西药布洛芬组小鼠海马TLR4、MyD88及p-NF-κB蛋白表达降低（P＜0.05）。 3六味地黄丸含药血清对Aβ诱导PC12细胞TLR4/NF-κB信号通路的影响 3.1不同浓度Aβ25-35对PC12细胞的影响 用终浓度分别为10、20、30、40μM的Aβ25-35与PC12细胞分别作用24、36、48、72h后，随着Aβ25-35浓度和作用时间的增加，细胞存活率逐渐降低，有明显的剂量、时间依赖性。与对照组（加入等体积的无菌去离子水）相比，10、20μMAβ25-35组细胞存活率无统计学差异（P＞0.05），作用效果不明显。30μM和40μMAβ25-35组在各作用时间存活率均明显降低（P﹤0.05），其中，40μMAβ25-35组存活率最低。 3.2siRNA干扰沉默PC12细胞MyD88的表达 将化学合成的三个MyD88siRNA序列以及负对照序列转染PC12细胞，通过Real-TimePCR筛选沉默效率最高的序列为MyD88-3，通过westernblot检测，该序列对MyD88蛋白表达与对照组相比下调85±6.3%（p﹤0.01）。 3.3各组PC12细胞培养基上清TNF-α和IL-1β含量的比较 模型组PC12细胞培养基中TNF-α和IL-1β含量显著增高（P＜0.05），含药血清组、MyD88沉默组和VE组TNF-α和IL-1β含量均明显降低（P＜0.05）。 3.4各组PC12细胞TLR4、MyD88及NF-κBmRNA的表达情况 模型组PC12细胞TLR4、MyD88及NF-κBmRNA表达增高（P＜0.05）。与模型组相比，含药血清组、MyD88沉默组和VE组TLR4、MyD88及NF-κBmRNA表达降低（P＜0.05）。 3.5各组PC12细胞TLR4、MyD88及p-NF-κB蛋白的表达情况 模型组PC12细胞TLR4、MyD88及NF-κB蛋白表达增高（P＜0.05）。含药血清组、MyD88沉默组和VE组TLR4、MyD88及p-NF-κB蛋白表达降低（P＜0.05）。 结论： 1.六味地黄丸能够使APP/PS1双转基因小鼠定位航行实验潜伏期缩短，在平台所在象限停留时间，百分比，穿越平台次数均增高。六味地黄丸能够明显改善小鼠学习记忆障碍。2.APP/PS1双转基因小鼠海马出现大量Aβ沉积所致的老年斑，六味地黄丸能够有效降低其Aβ沉积，抑制As的过度激活。 3.六味地黄丸能够抑制TLR4/NF-κB信号转导途径，降低TNF-α和IL-1β的表达，从而通过减轻中枢免疫炎症反应，发挥抗AD的作用。 4.MyD88沉默后，TLR4/NF-κB下游因子NF-κBmRNA和蛋白表达均降低，MyD88介导的TLR4/NF-κB信号途径的激活是AD中枢免疫炎症反应的重要机制，为六味地黄丸从肾论治AD的理论提供实验支撑。
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