摘要
壳寡糖（COS）有较强的抗菌、抗炎和免疫增强功能，已被利用开发为功能饲料添加剂。但迄今为止，有关壳寡糖的肠道转运方式及免疫增强功能的机制尚不完全清楚，限制了药代学过程的阐明以及临床推广。本研究在确定COS灌服后的组织分布和代谢规律基础上，利用TMT蛋白质组学和真核有参转录联合分析，搜寻肠道COS潜在的跨膜转运关键分子。利用基因过表达/沉默等技术，进一步验证肠道COS的潜在跨膜转运分子。随后，研究了COS灌服早期粘膜免疫相关分子的表达变化，初步解析其免疫增强的效果及机制。 研究发现：（1）COS灌胃后1-2h内主要分布于胃、十二指肠和肾脏，2h达到吸收高峰。对十二指肠的蛋白质组和转录组的差异表达分子，经GO富集分析发现，COS灌服后1-1.5h差异分子主要富集到代谢功能，包括内肽酶、肽酶和水解酶的上调；KEGG分析发现1h时差异分子主要富集在代谢通路如胆固醇代谢、乙醚脂质代谢、戊糖和葡萄糖醛酸盐相互转化及药物代谢等。同时，0.5-2h差异表达分子均能显著富集到免疫相关功能和通路中，如初始免疫、肠道IgA产生免疫网络、B细胞受体信号通路、核因子κB（NF-κB）信号通路和细胞黏附因子（CAMs）信号通路等。（2）多组学联合分析发现跨膜转运分子β2-微球蛋白（B2m）、整合素β2（Itgb2）和溶质载体家族9亚家族a1（Slc9a1）在COS处理后表达升高（P＜0.05），该结果被WesternBlot（WB）和Real-timequantitativePCR（RT-qPCR）技术在体内、体外条件下进一步得到验证。特异性抑制B2m、Itgb2和Slc9a1蛋白后，MODE-K细胞转运COS的效率下降，以抑制Slc9a1蛋白后的转运效率下降最为明显（P＜0.01）。（3）分子对接分析显示COS和Slc9a1存在着通过氢键稳定结合的可能。进一步过表达MODE-K细胞中Slc9a1后，对FITC-COS的转运在1h-2h时较对照组显著提高（P＜0.01），说明Slc9a1过表达后细胞摄取FITC-COS的能力增强。特异性抑制剂抑制小鼠肠道Slc9a1分子后，肠组织中COS水平较对照组极显著降低（P＜0.01），说明Slc9a1在COS转运中发挥重要作用。（4）对转录组和蛋白质组数据的进一步挖掘显示，IgA生成途径的肠道免疫网络被激活，表现为多聚免疫球蛋白受体（pIgR），主要组织相容性复合体（MHC）Ⅰ，MHCⅡ，整合素β7（Itgb7）和C-C基序趋化因子配体28（Ccl28）等通路相关分子的表达显著增加（Plt;0.05）。对COS灌服后小鼠的血常规发现，2h-4h单核细胞和淋巴细胞的数量增加，通过WB，ELISA和RT-qPCR进一步检测IgA生成相关分子发现，COS处理后1h时，IgA、MHCⅡ、TGF-β1、IL-6和pIgR的表达显著增加（Plt;0.05）。而COS处理后1.5h，pIgR、MHCI和AID水平显著升高（Plt;0.05）。COS处理后2h时可见MHCⅡ和H2-Q10的表达显着增加（Plt;0.05）。 结果表明：（1）COS灌服后2h在胃肠道的吸收达到峰值。（2）COS给药后肠道差异表达分子主要富集于免疫和代谢相关通路。（3）肠道Slc9a1是COS转运的重要分子。（4）口服COS能通过激活sIgA生成相关通路而上调肠粘膜sIgA的分泌。
NETL