摘要
目的： 1.通过建立10批不同产地青钱柳水提物HPLC指纹图谱，分析青钱柳水提物中主要物质成分，并采用相似度分析，化学模块分析及含量测定对不同产地青钱柳进行质量评价，阐明青钱柳的化学物质基础及为青钱柳质量评价提供依据。 2.以青钱柳指纹图谱标定的四种指标性成分作为物质基础，运用网络药理数据库对四种指标性成分进行药理评价，进一步采用分子对接和分子动力学模拟筛选其中具有抑制α-葡萄糖苷酶的活性成分，并通过体外酶活实验验证虚拟筛选结果，探讨青钱柳活性成分抑制α-葡萄糖苷酶活性的可能性。 3.以HepG2细胞为研究对象，建立胰岛素抵抗HepG2(IR-HepG2)细胞模型，研究青钱柳及其活性成分对IR-HepG2细胞糖代谢，糖原合成及肝糖代谢关键酶的改善作用，并进一步深入考察其对IR-HepG2细胞IRS-1/PI3K/Akt胰岛素信号通路中关键因子影响作用，探讨青钱柳及其活性成分改善IR-HepG2的作用机制。 方法： 1.采用HPLC法建立10批不同产地青钱柳样品水提物的特征指纹图谱，色谱柱为X-peonyxC18色谱柱，流动相为0.2%磷酸水溶液（A）-乙腈（B），梯度洗脱程序为：0~15min，92%~92%A；15~50min，92%~82%A；50~60min，82%~81%A；梯度洗脱，流速1.0mL/min，柱温30℃，检测波长为280nm。以原儿茶酸(PCA)、绿原酸(CGA)、咖啡酸(CFA)及芦丁(Rutin)为质量控制指标，并进行化学模块分析和含量测定，对不同产地的青钱柳进行质量评价，为青钱柳的物质基础和质量评价提供理论依据。 2.采用网络药理数据库对四种指标性成分进行药理安全性评价。通过分子对接和分子动力学模拟技术虚拟筛选四种PCA、CGA、CFA和Rutin化合物与α-葡萄糖苷酶的亲和力，并分析其作用分子机制，进一步采用对硝基苯基-α-D-吡喃葡萄糖苷(PNPG)法，以阳性药阿卡波糖为对照，研究青钱柳及其活性物质CGA和Rutin对α-葡萄糖苷酶活性的抑制作用及作用机制。 3.不同浓度的CP、PCA、CGA、CFA和Rutin干预HepG2细胞24h后，MTT法检测药物对细胞活力的影响。 4.采用10-5、10-6、10-7、10-8mol/L的高胰岛素浓度刺激HepG2细胞36小时，研究产生IR-HepG2细胞的最佳浓度，进一步采用最佳浓度胰岛素诱导HepG2细胞不同作用时间，确定胰岛素刺激作用造模的最佳作用浓度和时间，建立稳定可靠的IR-HepG2细胞模型。 5.不同剂量的CP（25、50、100μg/mL）、PCA（125、250、500μmol/L）、CGA（31.25、62.5、125μmol/L）、CFA（35、70、140μmol/L）和Rutin（1.563、3.125、6.25μmol/L）各高，中，低三个浓度梯度进行干预IR-HepG2细胞24h后，采用葡萄糖氧化酶法检测各组药物对IR-HepG2细胞葡萄糖消耗量的影响。 6.采用糖原，丙酮酸激酶(PK)和总超氧化物歧化酶(T-SOD)测定试剂盒，测定CP、CGA及Rutin各高剂量组干预IR-HepG2细胞24h后，细胞丙酮酸激酶活力，肝糖原和总SOD含量。 7.采用RT-qPCR法检测CP、CGA及Rutin各高剂量组干预IR-HepG2细胞24h后IRS-1/PI3K/Akt胰岛素信号通路INSR、IRS-1、PI3K、Akt2及GSK-3β基因的mRNA表达。 结果： 1.建立了10批青钱柳水提物的指纹图谱，匹配了9个共有峰，指认出了其中4个共有峰，分别为PCA、CGA、CFA及Rutin。指纹图谱相似度结果表明10批不同产地的青钱柳相似度值均大于0.9，相似度良好，符合建立指纹图谱的要求。化学模块分析结果表明，10批不同产地青钱柳被分为3类。含量测定结果显示不同产地青钱柳品质存在一定的差异。 2.网络药理数据库筛选结果表明PCA、CGA、CFA、Rutin具有良好的药理学参数和安全性。分子对接结果显示4个化合物与α-葡萄糖苷酶结合能均小于-5.0kcal/mol，具有良好的结合力。分子动力模拟学结果显示，CGA和Rutin在结合能及分子动力学各项参数与阿卡波糖最为接近，说明这两种活性化合物可能具有抑制α-葡萄糖苷酶的作用。体外酶活实验表明青钱柳及其主要活性物质CGA和Rutin对α-葡萄糖苷酶的半数抑制浓度(IC50)分别为3599μg/mL、398.9μg/mL和351.8μg/mL，并呈浓度依赖性，酶活动力学结果显示CGA和Rutin均属于混合型抑制类型。 3.MTT结果显示，CP给药浓度为25、50、100μg/mL，PCA给药浓度为125、200、500μmol/L，CGA给药浓度为31.25、62.5、125μmol/L，CFA给药浓度为35、70、140μmol/L，Rutin给药浓度为1.563、3.125、6.25μmol/L时，干预HepG2细胞24h后对HepG2细胞无明显毒性(P＞0.05)。 4.高浓度胰岛素不同作用浓度和作用时间结果显示，IR-HepG2细胞最佳造模条件为：10-7mol/L的胰岛素，刺激HepG2细胞36h，可成功诱导出稳定性良好的IR-HepG2细胞。 5.不同剂量的CP、PCA、CGA、CFA、Rutin干预IR-HepG2细胞24h后，与模型组相比，PCA和CFA对IR-HepG2细胞葡萄糖消耗无显著影响(P＞0.05)，CP、CGA和Rutin对IR-HepG2细胞葡萄糖消耗有改善作用，相比模型组具有显著改善作用(P＜0.05或P＜0.01)，且改善作用随着浓度的升高而增强。 6.IR-HepG2细胞模型建立后，HepG2细胞内糖原含量，丙酮酸激酶(PK)活性和总SOD含量均显著下降(P＜0.01)。高剂量CP、CGA和Rutin组干预IR-HepG2细胞24h后，相比模型组，均可显著提高IR-HepG2细胞内肝糖原含量，PK活性和总SOD的含量(P＜0.05或P＜0.01)。 7.IR-HepG2细胞模型建立后，与正常组相比，模型组HepG2细胞IRS-1/PI3K/Akt信号通路中关键因子INSR、IRS-1、PI3K、Akt2和GSK-3β的mRNA表达均显著下调(P＜0.01)，经高剂量CP、CGA和Rutin给药干预24h后，三者给药组相比模型组均能显著上调INSRmRNA、IRS-1mRNA、PI3KmRNA和GSK3-βmRNA的表达量(P＜0.01)；其中Akt2基因，CGA组相比模型组并未能显著上调Akt2mRNA的表达量(P＞0.05)，无统计学意义，但表达量相比模型组有一定程度的提升，CP组和Rutin高剂量组则可以显著上调Akt2mRNA的表达量(P＜0.05)。 结论： HPLC指纹图谱结果显示，10批不同产地的青钱柳指纹图谱相似度良好，样品化学指纹图谱之间相似度均大于0.9，化学模块分析将10批青钱柳分为三类，不同产地青钱柳PCA、CGA、CFA、Rutin四种指标性成分含量存在一定的差异。网络药理参数评价PCA、CGA、CFA、Rutin，四者均具有良好的药理安全性。分子对接结果四种活成分与α-葡萄糖苷酶结合活性良好，结合能均小于-5.0kcal/mol，分子动力学表明CGA和Rutin在于α-葡萄糖苷酶结合过程与阳性药阿卡波糖相似，可能是潜在的α-葡萄糖苷酶抑制剂。体外酶活实验表明CP及其主要活性成CGA和Rutin对α-葡萄糖苷酶具有一定抑制作用，CGA和Rutin两者均为混合型抑制类型。CP、CGA和Rutin对IR-HepG2细胞葡萄糖消耗，肝糖原合成、丙酮酸激酶(PK)活性及总SOD含量具有显著改善作用，其作用机制可能与其调节IRS-1/PI3K/Akt信号通路中的关键因子INSR、IRS-1、PI3K、Akt2、GSK-3βmRNA表达水平相关。
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