摘要
研究目的： 1.探究汉塞巴通体是否可形成活的非可培养（VBNC）状态。 2.研究汉塞巴通体VBNC状态的生理特性与药物敏感性。 3.研究汉塞巴通体VBNC状态的形成机制。 研究方法： 1.在本实验室此前建立的SYBRGreenI/PI细菌活性染色法的基础上，针对汉塞巴通体对染料的浓度、配比、染色时间等进行了优化，建立汉塞巴通体VBNC状态的检测方法。 2.通过38.8℃培养或药物处理汉塞巴通体，使其进入VBNC状态。 3.透射电镜观察汉塞巴通体VBNC状态的细胞结构变化。 4.通过SYBRGreenI/PI细菌活性染色法评估VBNC状态的汉塞巴通体对药物的敏感性。 5.使用聚丙烯酰胺凝胶电泳结合质谱技术和RT-qPCR等方法，研究汉塞巴通体VBNC状态形成的机制。 研究结果： 1.SYBRGreenI/PI活性染色方法比PMA-qPCR的方法更加简便，快捷，使用此方法计数的活菌数目更为接近真实的活菌量。 2.汉塞巴通体在38.8℃培养或者达托霉素、链霉素、庆大霉；‘素处理下都可进入VBNC状态，将VBNC状态的汉塞巴通体转移至新鲜培养基，使细菌处于适宜环境可使其复苏至可培养状态，并且添加羊血有助于该菌更好的复苏。 3.通过透射电子显微镜观察发现VBNC状态的汉塞巴通体具有完整的细胞膜，细胞壁结构和丰富的胞内容物，胞内物质相比于对数期和稳定期细菌更加致密。 4．VBNC状态的汉塞巴通体相比于对数期细菌高表达铁吸收调节蛋白，而产能相关蛋白质和DNA复制相关的蛋白质表达降低。 5.汉塞巴通体的VBNC状态与对数期相比高表达毒素基因（yafQ1，yafQ2），持留基因（glpD，spoT），药物泵基因（acrB，macB，vecB）和感染内皮细胞相关基因（bafA，trwE，vriB4）。 研究结论： 1.SYBRGreenI/PI活性染色是研究汉塞巴通体VBNC状态的有效方法。 2.汉塞巴通体能够进入VBNC状态，并且条件适宜时可复苏至可培养状态。 3.汉塞巴通体的VBNC状态具有完整的膜结构和胞内容物。 4．VBNC状态的汉塞巴通体较稳定期持留菌对抗生素更加耐受，更难被药物杀死。 5.汉塞巴通体的VBNC状态产能和DNA复制相关蛋白质水平表达下调，高表达药物泵基因和持留基因，并且感染内皮细胞相关基因表达也上调。但该结论还需使用遗传学手段进一步验证。
NETL