摘要
通过对细胞内疾病相关基因直接操纵而永久性的恢复细胞内正常功能网络的CRISPR/Cas9基因编辑疗法，正在改变目前基因治疗领域的格局。相比于过继性疗法，体内水平的基因编辑治疗对于递送系统的效率、安全性、精确性都有着更为严格的要求。Cas9蛋白与sgRNA在体外组装形成的核酸蛋白复合物(ribonucleoprotein，RNP)是体内基因治疗中最为安全的CRISPR功能形式，但是目前临床常用的脂质纳米颗粒和腺相关病毒载体无法实现RNP在体内水平的有效递送，因此，建立有效的RNP形式的CRISPR/Cas9体内基因编辑系统成为基因治疗领域发展的迫切需求。 本课题组前期建立了一种新型的基于多功能嵌合肽的生物大分子递送系统eTAT(enhancedTAT)，该系统具有内吞小泡逃逸效率高、血清耐受程度高的优势，而且在体内水平仍能够高效递送生物大分子。本研究发现eTAT递送系统不仅可以高效的递送蛋白质入胞，也能够将蛋白-核酸复合物形式的货物分子递送入胞。基于此，本研究开展了基于eTAT嵌合肽的CRISPR/Cas9基因编辑系统的的构建，并且评估了该方法用于体内编辑的可行性和在疾病治疗中的潜在应用价值。本研究主要包括基于多功能嵌合肽递送的基因敲除编辑体系以及同源修复体系两个部分。 第一部分主要为基于eTAT-Cas9RNP基因敲除体系的建立及应用。该系统在细胞水平能够实现对BFP基因约70％的敲除效率，优于CRISPRMAX脂质体转染试剂，而且展现出编辑速度快、脱靶率低、无细胞选择性等优势。在小鼠模型上利用eTAT-Cas9RNP对PD-L1以及Plk1基因的有效敲除，实现了恶性肿瘤的治疗，确认了eTAT-Cas9RNP在体内基因编辑的潜力。 第二部分围绕嵌合肽递送核酸蛋白复合物的同源修复编辑体系的建立及应用。同源修复基因编辑由于需要同时引入Cas9RNP以及供体(donor)DNA在基因治疗应用中更具挑战性。为此，我们首先构建了基于eTAT嵌合肽融合DNA特异性结合蛋白方式的新型donorDNA递送系统，并在与eTAT-Cas9RNP联合后分别建立了双组份基因修正体系以及基因插入体系。随后，将功能元件一体化后构建的All-in-One同源修复复合物，不但能够实现体内治疗中所需的单个细胞内Cas9RNP以及donorDNA的共递送，而且由于DSBs与修复模版在时空上更为接近伴随着修复效率的提升。All-in-OneHDR复合物随后被用于FAH基因突变导致的肝脏疾病遗传性酪氨酸血症的基因修复治疗中，Fahmut/mut基因突变小鼠经All-in-OneHDR治疗后，肝脏内FAH蛋白恢复表达，肝脏生理功能部分恢复，而且Fahmut/mut小鼠体重维持正常生长，从而证实了All-in-OneHDR在体内同源修复基因治疗中的有效性。此外，All-in-OneHDR在治疗过程中未表现出明显的毒性，具有体内应用中的安全性优势。 综上所述，基于嵌合肽的CRISPR/Cas9基因编辑系统的建立，为体内水平的基因编辑提供全新的手段，也将成为基因编辑治疗的重要候选分子。
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