摘要
目的探讨Wnt家族成员5a（Wnt5a）对肝星状细胞（HSCs）增殖和迁移能力的影响，并确定靶向Wnt5a的miR-194-5p，以及miR-194-5p对HSCs的作用，为肝纤维化（HF）的诊断及防治提供新靶标。 方法1Westernblot、免疫荧光和实时荧光定量聚合酶链反应（qRT-PCR）检测转化生长因子-β1（TGF-β1）处理的LX-2细胞中α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA）、I型胶原α1链（COL1A1）和Wnt5a的表达水平。2CCK8、集落形成、划痕、Transwell和β-半乳糖苷酶实验测定转染si-Wnt5a后LX-2细胞的增殖、集落形成、衰老和迁移能力。3miRNAs表达谱芯片分析假手术组与胆总管结扎肝纤维化组大鼠肝组织中差异表达的miRNAs。4应用TargetScan、miRWalk和ENCORI网站预测靶向Wnt5a的miRNAs，并通过双萤光素酶报告实验进行验证。5qRT-PCR测定TGF-β1处理的LX-2细胞中miR-194-5p的表达水平。6qRT-PCR和Westernblot检测转染miR-194-5pmimics或miR-194-5pinhibitor后LX-2细胞中α-SMA、COL1A1和Wnt5a的mRNA和蛋白表达水平。7CCK8、集落形成、划痕、Transwell和β-半乳糖苷酶实验测定转染miR-194-5pmimics或miR-194-5pinhibitor后LX-2细胞的增殖、集落形成、衰老和迁移能力。 结果1TGF-β1（10ng/mL）处理的LX-2细胞中α-SMA、COL1A1和Wnt5a的mRNA和蛋白的表达水平以及α-SMA和Wnt5a的荧光情况，TGF-β1（10ng/mL）处理的人肝原代正常成纤维细胞（NFs）中α-SMA和Wnt5amRNA的表达水平，与各自对照组相比均显著升高，差异均具有统计学意义（Plt;0.05）。2与对照组相比，转染si-Wnt5a-1、si-Wnt5a-2和si-Wnt5a-3的LX-2细胞中Wnt5amRNA和蛋白表达水平均降低，差异均具有统计学意义（Plt;0.05）。3与对照组相比，si-Wnt5a-2和si-Wnt5a-3组LX-2细胞中α-SMA、COL1A1和Wnt5a的mRNA和蛋白表达水平降低，差异均具有统计学意义（Plt;0.05）。4si-Wnt5a-2和si-Wnt5a-3抑制LX-2细胞的增殖、集落形成和迁移能力，促进LX-2细胞衰老，与对照组相比，差异均具有统计学意义（Plt;0.05）。5miRNAs表达谱芯片分析假手术组与胆总管结扎肝纤维化组大鼠肝组织中差异表达的miRNAs，筛选出后续研究中下调的miRNAs。TargetScan、miRWalk和ENCORI生物信息学网站，均预测出靶向Wnt5a的miRNA：miR-194-5p。通过双萤光素酶报告实验对各组LX-2细胞的萤光素酶活性进行测定，与各自组别的对照组相比较，野生型萤光报告载体与miR-194-5pmimics共转染组萤光素酶活性降低，差异具有统计学意义（Plt;0.05）；突变型萤光报告载体与miR-194-5pmimics共转染组萤光素酶活性无明显变化。6与对照组相比，TGF-β1（10ng/mL）处理的LX-2细胞和NFs细胞中miR-194-5p水平明显下降，差异均具有统计学意义（Plt;0.05）。7分别转染miR-194-5pmimics和miR-194-5pinhibitor后，LX-2细胞中miR-194-5p表达水平前者升高，后者降低，差异均具有统计学意义（Plt;0.05）。8miR-194-5p抑制LX-2细胞中α-SMA、COL1A1和Wnt5a的mRNA和蛋白表达，差异均具有统计学意义（Plt;0.05）。9miR-194-5p抑制了LX-2细胞增殖、集落形成和迁移能力，促进了LX-2细胞衰老，与各自对照组相比，差异均具有统计学意义（Plt;0.05）。 结论1沉默Wnt5a基因能抑制LX-2细胞活化，促进LX-2细胞衰老。2Wnt5a是miR-194-5p的直接靶基因。3miR-194-5p可抑制LX-2细胞的活化，促进LX-2细胞衰老。
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