摘要
研究背景:非酒精性脂肪性肝病(non-alcoholicfattyliverdisease，NAFLD)是世界上最常见的慢性肝病，目前西医治疗具有局限性，因此，积极寻找治疗手段防治NAFLD并阻断其发展为肝硬化等晚期肝病具有重大意义。茯苓是中国传统中药，临床常和其他中药搭配用于NAFLD的治疗。茯苓多糖是茯苓的主要成分，研究表明茯苓多糖具有抗氧化、抗炎、抗肿瘤等广泛治疗作用。本研究主要着眼于茯苓及主要成分茯苓多糖对NAFLD的作用与机制进行探讨。 研究目的:探究茯苓及主要成分茯苓多糖减轻脂质累积，减轻炎症和氧化应激，改善NAFLD的作用机制。 研究方法: 1.斑马鱼实验:根据96h的毒理实验确定中药药物浓度。将受精后3天(dayspostfertilization，dpf)的斑马鱼浸泡于0.05％硫代乙酰胺(Thioacetamide，TAA)溶液中72小时建立斑马鱼幼鱼NAFLD模型，同时药物干预组给予茯苓溶液(25μg/ml，50μg/ml，100μg/ml)或茯苓多糖溶液(1mg/ml，2mg/ml，4mg/ml)。将斑马鱼幼鱼进行石蜡切片和冰冻切片，分别采用油红O染色、H&E染色、免疫荧光染色检测斑马鱼幼鱼肝脏病理变化;提取RNA，使用qRT-PCR检测相关基因表达情况。 2.小鼠实验:将8-10周小鼠分组，使用西方饮食模型饲料喂养6周，建立NAFLD小鼠模型。药物干预组给予茯苓水煎剂溶液(1.67g/kg、3.3g/kg、6.7g/kg)或茯苓多糖溶液(100mg/kg、200mg/kg、400mg/kg)，选用阿托伐他汀片(20mg/kg)作为阳性对照组。造模第7周时开始药物干预，每2天灌胃一次，持续6周。造模结束后收集小鼠血清和肝脏。采用血清检测、H&E病理染色、油红O染色、尼罗红染色、荧光探针检测、免疫组化染色、免疫荧光染色检测小鼠肝脏变化与蛋白表达。 3.细胞实验:选择小鼠肝细胞系AML-12细胞培养，根据CCK-8实验确定细胞实验茯苓多糖溶液浓度(25μg/ml，50μg/ml，100μg/ml)。使用脂质混合物(LipidMixture)诱导AML-12细胞NAFLD模型，分别加入Nrf2激动剂和抑制剂，进行细胞爬片和细胞铺板，采用油红O染色，尼罗红染色，ROS探针检测，免疫印迹检测细胞脂滴累积、氧化反应和蛋白表达。 研究结果: 1.应用TAA成功诱导斑马鱼幼鱼NAFLD模型。H&E染色结果显示与模型组相比，茯苓能够减少斑马鱼幼鱼肝脏脂质累积;茯苓多糖显著减少斑马鱼幼鱼肝脏内脂质累积，显著降低斑马鱼炎症基因和脂肪相关基因的表达水平，升高Nrf2基因的表达水平。 2.NAFLD小鼠模型肝脏H&E染色结果显示，与对照组相比，模型组肝脏脂质累积显著。茯苓和茯苓多糖处理组显示，二者均能改善小鼠肝脏的脂肪性变，降低脂质累积，高浓度组改善情况接近阿托伐他汀阳性药组。茯苓多糖减少肝脏炎症和氧化应激，上调Nrf2和HO-1蛋白的表达，提高肝脏抗氧化能力。 3.AML-12细胞实验结果显示，与模型组相比，茯苓多糖处理组能够降低细胞脂滴沉积，减少氧化，升高Nrf2、HO-1蛋白表达量;Nrf2抑制剂ML385处理组加入茯苓多糖后，Nrf2的表达重新升高。 结论:茯苓与茯苓多糖均能改善NAFLD脂质累积，茯苓多糖调控Nrf2/HO-1信号通路，减轻肝脏炎症和氧化应激的发生。
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