摘要
造血激素（Astakine）是一种具有促进造血干细胞增殖分化的内源性细胞因子，与脊椎动物促动力素蛋白具有同源性，并参与无脊椎动物造血过程和先天性免疫反应。尽管在对虾和螃蟹中中已报导其可能参与机体免疫防御，但具体介导的分子信号传导机制仍不明确。为更好地探究Astakine分子功能，本课题以罗氏沼虾为研究对象，克隆鉴定了罗氏沼虾Astakine基因（MrAst)及其受体ATPsyn-β（MrATPs-β）。由此开展了以下3个方面的工作：（1）通过RNAi技术初步探究MrAst在先天性免疫方面的作用；（2）通过原核表达获得rMrAst重组蛋白，并通过体内注射探究rMrAst对细胞增殖的影响；（3）通过酵母双杂交确定MrAst与其受体MrATPs-β的互作并初步探究了MrAst与其受体的信号传导通路。取得的研究内容如下： （1）MrAst在抗革兰氏阴性菌和抗病毒的先天性免疫应答中发挥作用 本研究成功克隆鉴定了MrAst基因并发现其在血淋巴细胞和神经组织中高表达。生物信息学分析结果表明MrAst具有保守的10个半胱氨酸残基，与甲壳动物中的Astakine同源。通过RNAi技术敲降MrAst基因表达量，发现下调MrAst基因能促使血细胞总数和酚氧化酶活性的显著下降并增强溶菌酶活力。MrAst的敲降可影响免疫通路相关基因包括血蓝蛋白、STAT、酚氧化酶原、造血生长因子（CHF）、Toll样受体、IMD、Relish、甲壳肽和抗脂多糖因子等的表达变化，其中ALF1以及IMD、Relish显著升高，推测MrAst可能通过IMD通路介导抗菌肽的产生。而且，罗氏沼虾体内缺乏MrAst会导致血细胞大量凋亡，且上调凋亡通路凋亡酶体Caspase、P53基因和水解酶CathepsinB，并下调细胞色素P450的表达量。推测基因的缺失促使细胞P53基因的大量转录，并激活凋亡酶Caspase3、Caspase9执行血细胞凋亡，并可减弱细胞吞噬作用。在病原感染实验中，MrAst基因在被副溶血弧菌和虾虹彩病毒（DIV1）感染的罗氏沼虾血淋巴和鳃组织中都呈现显著上调的表达模式。通过干扰MrAst后感染病原实验发现，MrAst下调会促使罗氏沼虾对副溶血弧菌和DIV1更为敏感，加快染病罗氏沼虾的死亡速度并造成更高死亡率。这些结果表明，MrAst参与机体抗革兰氏阴性菌以及抗病毒的免疫应答过程，并对机体免疫抵抗力有积极作用。推测MrAst主要通过维持血细胞稳态的方式参与机体抵御病原的免疫反应。 （2）rMrAst可促进造血组织细胞增殖 通过构建原核表达载体并进行蛋白印迹鉴定，确定成功诱导表达出rMrAst可溶性重组蛋白。通过动物实验体内注射rMrAst和Edu荧光标记进行总细胞计数（THC）和组织切片的观察，结果表明，rMrAst可显著增强造血组织细胞的DNA复制活动，但对神经细胞无明显作用。THC表明rMrAst添加后4h后血淋巴中细胞数量明显上升，并有往半颗粒细胞分化的趋势。此外，注射rMrAst蛋白可明显促进体内CHF的转录，结合RNAi的结果，初步确定CHF可受MrAst的直接调控。综合结果，明确rMrAst可促进血细胞增殖分化，并可能通过下游基因CHF发挥作用。 （3）MrAst与MrATPs-β的互作及信号通路初探 我们成功克隆得到MrATPs-β基因，生物信息学分析得出MrATPs-β与甲壳动物ATPsyn-β高度同源。qPCR结果表明MrATPs-β基因在罗氏沼虾所有组织广泛分布，其中在肝胰腺中表达量最高。酵母双杂交结果进一步证明了MrAst与MrATPs-β有强互作关系。我们进一步对MrAst、MrATPs-β以及CHF之间的关系进行验证。对罗氏沼虾造血组织进行体外孵育，结果发现，MrATPs-β的下调可使MrAst的转录水平上升，CHF尽管有上升趋势但不明显；单独添加rMrAst可显著提高CHF的转录水平，并在沉默MrATPs-β后添加rMrAst的情况下，表明rMrAst的添加可使MrATPs-β表达上升补偿dsATPs-β的干扰。结合体内注射和体外孵育的结果，更明确CHF受MrAst的直接调控，且MrATPs-β为MrAst的受体，初步推测出MrAst的信号通路。初步推测MrAst可能通过与MrATPs-β结合从而改变膜内ATP/ADP浓度，进而激活胞内级联反应，促进CHF或其他信号通路参与罗氏沼虾先天免疫防御和介导细胞增殖分化。
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