摘要
在当今社会，疲劳是一种常见的生理现象。长期过度疲劳会降低工作效率，削弱人体抵抗力，影响人类健康，甚至产生慢性生理性疾病。大量研究表明食源性低聚肽不仅具有显著的抗疲劳作用，而且具有特异性高、来源广泛、毒副作用小等特征，展现了广阔的应用前景。扁舵鲣鱼是东海、南海普遍存在的一种低值海洋鱼类，目前未得到良好的利用。其体内不仅含有丰富的肌肽、鹅肌肽等抗疲劳功能因子，并且蛋白质、氨基酸组成也具有抗疲劳肽的结构特点。因此本文根据扁舵鲣鱼的原料特性和抗疲劳问题展开研究，以扁舵鲣鱼为原料，通过可控酶解制备扁舵鲣鱼低聚肽，利用动物实验评价扁舵鲣鱼低聚肽的抗疲劳功效，并对其功能因子进行分离纯化，为挖掘扁舵鲣鱼的生理活性以及开发扁舵鲣鱼作为抗疲劳功能性食品提供理论依据。主要研究内容与结果如下： （1）通过酶法制备扁舵鲣鱼低聚肽，以DPPH自由基清除率为主要指标，低聚肽含量为辅助指标，利用单因素试验和响应面优化扁舵鲣鱼酶解工艺。结果显示，木瓜蛋白酶酶解条件与扁舵鲣鱼自溶最优条件相匹配（pH6、55℃），确定木瓜蛋白酶对扁舵鲣鱼进行水解后，确定最优水解条件为：pH6，酶解温度60℃，酶解时间4h，物料比1:3，加酶量600u/g，此时DPPH清除率为75.71±0.79%，低聚肽含量为97.69±1.16%。 （2）通过5kDa、1kDa的超滤膜将扁舵鲣鱼低聚肽进行分级，以DPPH自由基清除率为体外指标，筛选出活性最强的组分，然后利用小鼠负重游泳试验评估其抗疲劳活性。结果发现，lt;1kDa的超滤组分（ATO）显示出高抗氧化活性，并且动物实验结果表明，ATO使小鼠在力竭游泳试验中的运动时间显著延长0.81-1.62倍（Plt;0.05），肝糖原水平显著增加0.60-1.63倍（Plt;0.05），肌糖原水平显著增加9.52-10.02%（Plt;0.05），乳酸（16.46-17.21%）和尿素氮（34.88-41.91%）水平均显著下降（Plt;0.05）；ATO还提高了抗氧化活性，降低了丙二醛水平。可见，ATO能够通过改善能量代谢、提高内源性抗氧化酶的活性发挥抗疲劳作用；并且体内抗疲劳和抗氧化的相关性分析结果表明两者具有高度相关性。 （3）通过检测p-AMPK、T-AMPK、PGC-1α基因和蛋白的表达，初步分析ATO抗疲劳作用的分子机制，并且探索其对疲劳引起的心肌损伤的改善作用。结果表明，ATO干预能上调AMPK/PGC-1α信号通路相关基因和蛋白表达量，同时发现ATO对力竭小鼠心肌形态结构具有改善作用，并且提高了小鼠心肌抗氧化能力：SOD活性显著上升了1.69-88.48%（Plt;0.05），GSH-Px显著提高了1.54-1.65倍（Plt;0.05），MDA含量显著下降了18.00-26.06%（Plt;0.05）。可见，ATO通过调控小鼠骨骼肌AMPK/PGC-1α信号通路发挥抗疲劳作用，同时对力竭小鼠心肌具有保护作用。 （4）以体外DPPH自由基清除率为指标，采用凝胶过滤层析和反相高效液相色谱对ATO连续分离，最后通过XevoG2-XSQ-TOF鉴定和分析目标功能肽序列。结果显示，3个抗疲劳肽氨基酸序列分别为β-丙氨酸-1-甲基-L-组氨酸（241D）、Gly-Ala-Gly-Gly-Pro（357Da）和Val-Glu（246Da）。
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