摘要
生物大分子药物因其具有高活性、高特异性、低毒性和广泛的药物靶点等诸多优势，已成为新药研究的热点。且与传统基因调控药物相比，基于蛋白和多肽药物的治疗显示出更快的作用，更大的功能强度和持续时间的可控性，并且没有遗传毒性。但是，细胞膜的选择通透性使得蛋白质药物难以通过细胞膜作用于胞内潜在药物靶点，限制了蛋白质药物的开发。基于细胞穿膜肽(cellpenetratingpeptide，CPP)的蛋白质胞内递送系统为利用细胞内靶点进行临床治疗或其他生物学应用开辟了可能性，其可以通过非侵入性途径将蛋白质货物输送至细胞。然而，目前CPP介导的生物大分子胞内递送仍存在内吞小泡逃逸不充分和血清耐受程度低两方面的问题，严重限制了其在体内递送中的应用。 本研究成功构建了一个高效的多功能嵌合肽递送系统(eTAT)，解决了目前穿膜肽递送系统面临的两大主要问题，且在细胞水平和动物水平均能高效的递送蛋白质分子入胞并发挥其生物学功能，为针对胞内靶标的大分子药物的研究和应用奠定了基础。本研究包括以下两个部分的工作。 第一部分为eTAT递送系统的建立。基于对现有穿膜肽递送系统的系统分析，本研究在穿膜肽的基础上，创造性的引入pH依赖性膜活性肽、内吞小泡特异性蛋白酶酶切位点以及促寡聚化多肽，设计并构建了一个多模块嵌合肽高效细胞递送系统，并建立了一种基于Split-GFP的细胞核内共定位评价方法，可通过流式分析研究递送系统的有效递送效率。我们发现，在CPP和cargo之间，同时引入pH依赖性膜活性肽和胞内蛋白酶酶切位点后，CPP介导cargo内化进入内吞小泡后酶切位点被蛋白酶切割，使Cargo与CPP分离，同时内吞小泡膜结构被pH依赖性膜活性肽破坏，二者协同作用从而显著提升cargo的逃逸和释放效率。在此基础上，本研究进一步引入寡聚化多肽促使CPP-Cargo复合物寡聚化，以弱化血清中负电分子对CPP内化作用的影响。我们发现，通过引入Leucinezipper能够有效提升cargo的内化效率和血清耐受程度。最终，本研究构建的高效递送系统由四个元件构成:包括细胞穿膜肽TAT、pH依赖性膜活性肽、内吞小泡特异性蛋白酶酶切位点以及亮氨酸拉链基序，我们命名为eTAT(enhancedTAT)系统。此外，我们通过比较eTAT和TAT介导eGFP细胞内化浓度以及GFPβ1-10入胞后生成的Split-GFP浓度进行定量分析，发现相比TAT，eTAT的总内化效率可提升4倍，有效递送效率（小泡逃逸）提升3.3倍，总体递送效率可提升13倍。 第二部分旨在研究eTAT递送系统用于递送生物大分子药物的可行性。蛋白磷酸酶1B(ProteinPhosphatase1B，Ppm1b)可通过对受体相互作用蛋白3（receptor-interactingprotein3，RIP3）去磷酸化抑制肿瘤坏死因子-α(TumorNecrosisFactor-alpha，TNFα)诱导的程序性细胞坏死。首先，我们在细胞水平证实eTAT-Ppm1b可以高效入胞并使RIP3去磷酸化，进而显著降低TNFα诱导的细胞坏死水平。进一步研究eTAT-Ppm1b经尾静脉注射BALB/c小鼠后的器官分布，发现eTAT-Ppm1b主要分布于盲肠、肝脏和肾脏等器官，且显著高于TAT-Ppm1b，证明了eTAT用于体内递送生物大分子的可行性。在此基础上，通过BALB/c小鼠模型研究发现，静脉注射eTAT-Ppm1b可有效抑制肿瘤坏死因子-α诱导的全身炎症反应（SIRS）和对乙酰氨基酚(APAP)诱导的致死性急性肝衰竭。同时，eTAT-Ppm1b还具有良好的安全性。 综上所述，本研究成功建立了一种高效的基于CPP的多功能嵌合肽系统eTAT，解决的CPP递送系统内吞小泡逃逸效率低和血清耐受程度低的问题，并证实该系统在细胞水平和动物水平均可以有效的递送生物大分子入胞并发挥其生物学活性。eTAT递送系统的研制为针对细胞内靶点的生物大分子药物的研发提供了新的手段，可进一步促进生物大分子药物的研究和应用，具有重要的科学意义和临床意义。
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