摘要
研究背景 对于局部晚期宫颈癌(Locallyadvancedcervicalcancer,LACC)患者，大量的研究结果显示，以顺铂为基础的同步化放疗（Concurrentchemoradiotherapy,CCRT）在肿瘤的局部控制和生存获益方面显著优于单纯放疗。即便如此，仍然有30％左右的患者最终会出现治疗失败。在CCRT基础上增加其它化疗药物的潜力有限。因此，探讨与顺铂的毒性谱互不重叠的新的生物靶向药物已经成为未来的研究方向。血管内皮生长因子（Vascularendothelialgrowthfactor,VEGF）是诱导肿瘤血管生成的主要因素之一，它通过激活其受体VEGFR(Vascularendothelialgrowthfactorreceptor,VEGFR)，在肿瘤的生长、转移、复发等方面发挥重要作用。重组人血管内皮抑制素（恩度）作为抗肿瘤血管靶向药物，其联合放疗和/或化疗的安全性及有效性，已经在包括头颈部肿瘤、肺癌、食道癌等多种类型肿瘤中得到证实。在宫颈癌方面，对小鼠宫颈癌移植瘤模型的研究发现，在同步化放疗基础上增加恩度可以显著降低肿瘤细胞活性，减少淋巴结转移几率，并且可以抑制肿瘤血管形成。然而，在以调强放疗（Intensity-modulatedradiationtherapy,IMRT）和三维近距离治疗为代表的精准放疗时代，恩度联合CCRT的疗效如何，目前还没有肯定的答案。 恩度主要作用于血管内皮细胞，减少其增殖与侵袭能力，减少新生血管的产生，从而削弱肿瘤细胞进一步生长的能力。放疗本身也会抑制血管内皮细胞，恩度通过抑制血管内皮细胞增强放疗的作用，从而使得恩度联合放疗可以更好地发挥杀伤肿瘤的效应。VEGF是促进血管生成的重要蛋白，其受体VEGFR-1、2、3与血管形成显著相关，它们是目前抑制血管生成的主要目的蛋白。研究表明，恩度可以影响腹水产生、血管形成、肿瘤增殖等，但其确切的分子机制尚未完全清楚。同时，在化放疗基础上联合恩度对宫颈癌的功能影响，尚未见相关报道。 本课题将分为两部分，分别探讨恩度联合CCRT对比单纯CCRT治疗LACC的有效性及毒性反应，以及恩度联合同步化放疗对宫颈癌细胞和裸鼠成瘤的作用及其调控宫颈癌血管形成的分子机制。 第一部分恩度联合同步化放疗治疗局部晚期宫颈癌的前瞻性随机对照研究 目的 通过前瞻性随机对照研究，探讨恩度联合CCRT对比单纯CCRT治疗LACC的有效性及毒性反应。 材料与方法 本研究为前瞻性、随机对照、单中心研究。按照2∶1比例将符合条件的LACC患者随机分为CCRT联合恩度组(CCRT+E组)和CCRT组。所有患者均接受根治性盆腔IMRT及高剂量率三维近距离治疗。外照射期间两组患者均给予顺铂同步化疗，剂量为40mg/m2，每周1次，共5次。此外，CCRT+E组的患者在顺铂同步的基础上增加恩度，用法为7.5mg/m2/天，持续静脉泵入，第1-14天，每3周重复给药，共2周期。利用免疫组化方法检测肿瘤组织的VEGFR-2的表达情况。主要研究终点为无进展生存(Progression-freesurvival，PFS)和急性毒性反应，次要研究终点为总生存(Overallsurvival,OS)、无远处转移生存(Distantmetastasis-freesurvival，DMFS)和局部区域无复发生存（Locoregionalrecurrence-freesurvival，LRRFS），探索性研究终点为VEGFR-2表达与临床病理特征的相关性及其对疗效的影响。 结果 1.患者的基本情况:116例患者入组，其中CCRT+E组78例，CCRT组38例。两组患者在年龄、PS评分、FIGO分期、组织类型、盆腔淋巴结转移、腹主动脉旁淋巴结转移等方面均没有显著差异。CCRT+E组及CCRT组分别有2例和1例在治疗开始前离开本研究。两组的意向性治疗(Intention-to-treat，ITT)患者数分别为78例和38例，疗效评价采用ITT人群，安全性评价患者人数在两组分别为76例及37例。 2.治疗依从性:患者对治疗的依从性总体较好。所有患者完成了预定的外照射和后装治疗;CCRT+E组有70例(89.7％)完成了4个及以上周期化疗，其中，44例(56.4％)完成了5个周期;CCRT组有31例(81.6％)完成了4个及以上周期化疗，其中，17例(44.7％)完成了5个周期;在CCRT+E组，67例(87.2％)完成了2个周期的恩度治疗。 3.生存分析:PFS在CCRT+E组有改善的趋势，但未能达到预设的研究终点，CCRT+E组和CCRT组的1、2年PFS分别为91.4％vs.82.1％及80.8％vs.63.5％(p=0.091);两组患者的DMFS差异显著，1、2年DMFS分别为92.7％vs.81.1％及86.0％vs.65.1％(p=0.031);CCRT+E组和CCRT组的OS及LRRFS均没有显著差别。 4.多因素分析:FIGO分期、总治疗时间、化疗周期数、腹主动脉旁淋巴结是否转移、VEGFR-2表达情况是PFS的独立预后因素。 5.亚组分析:年龄≥60岁、ECOG评分1分、FIGO分期、组织类型、总治疗时间＞56天、化疗周期数＞3、盆腔淋巴结转移情况、腹主动脉旁淋巴结转移情况、VEGFR-2表达阳性时，PFS总体以CCRT+E组为优。 6.VEGFR-2表达状态对ITT人群远期疗效的影响:CCRT+E组及CCRT组分别有70.5％和73.7％的患者VEGFR-2表达呈阳性。VEGFR-2表达阳性的患者，其PFS及OS均较VEGFR-2表达阴性的患者显著延长。然而，VEGFR-2的表达状态对LRRFS和DMFS没有显著影响。 7.VEGFR-2表达状态对组内患者远期疗效的影响:在CCRT+E组，VEGFR-2表达阳性的患者，其PFS、OS、LRRFS及DMFS均较表达阴性的患者显著延长;在CCRT组，虽然总体来说，VEGFR-2表达阳性的患者其PFS、OS、LRRFS及DMFS较表达阴性的患者为差，但未能发现有显著的统计学意义。 8.VEGFR-2表达状态对组间患者远期疗效的影响:对于VEGFR-2表达阳性的患者，CCRT组+E的PFS、OS及DMFS显著优于CCRT组，而两组在LRRFS方面没有显著差异;当VEGFR-2表达阴性时，CCRT+E组和CCRT组在PFS、OS、LRRFS及DMFS等方面均没有显著差异。 9.急慢性毒性反应:两组患者的急慢性毒性反应相似，最常见的急性毒性反应是骨髓抑制、恶心、腹泻及乏力，主要表现为Ⅰ-Ⅱ级。慢性毒性反应主要表现为皮肤及皮下组织损害、大腿水肿及疼痛、放射性肠炎、放射性膀胱炎及肾积水，其发生率在CCRT+E组介于3.9％和10.5％之间，在CCRT组介于2.7％和13.5％之间，两组均没有发生Ⅲ-Ⅳ度慢性毒性反应。 结论 1.对于LACC，在CCRT基础上增加恩度的依从性较好，毒性反应可以耐受。 2.CCRT联合恩度可以显著提高DMFS并有改善PFS的趋势。 3.VEGFR-2表达阳性的患者，在CCRT基础上增加恩度可以显著提高PFS、OS、LRRFS、DMFS;VEGFR-2表达阳性的患者，单纯CCRT治疗的PFS、OS、LRRFS及DMFS较表达阴性的患者为差，但未能发现有显著的统计学意义。 4.VEGFR-2表达阴性时，在CCRT基础上是否增加恩度对PFS、OS、LRRFS及DMFS均没有显著影响。 第二部分恩度联合同步化放疗通过VEGFR-2/VEGF途径调控宫颈癌血形成分子机制的研究 目的 探讨恩度联合同步化放疗对宫颈癌细胞和裸鼠移植瘤的作用及其调控宫颈癌血管形成的分子机制。 材料与方法 构建VEGFR-2过表达或沉默慢病毒载体，在宫颈癌Siha与Hela细胞中进行VEGFR-2过表达或沉默并进行验证;设置空白对照组(Control)、同步化放疗组(CCRT)、同步化放疗联合恩度组(CCRT+E)、VEGFR-2过表达转染后同步化放疗联合恩度组(CCRT+VEGFR2+E)、VEGFR-2沉默转染后同步化放疗联合恩度组(CCRT+KD-VEGFR2+E)、空载转染后同步化放疗联合恩度组（CCRT+NC+E）;分别处理Hela与Siha宫颈癌细胞以及Huvec血管内皮细胞，检测细胞增殖凋亡变化，检测评估Huvec血管内皮细胞血管形成能力的变化;通过裸鼠移植瘤模型探讨过表达或沉默VEGFR-2后，恩度联合同步化放疗对体内肿瘤增殖的影响;检测经不同浓度的恩度处理后的Hela宫颈癌细胞的VEGF表达与蛋白核质定位变化;检测VEGF与VEGFR-2的蛋白半衰期;验证经恩度处理Hela宫颈癌细胞后VEGF与VEGFR-2的蛋白互作情况。 结果 1.在Hela与Siha细胞中，相对阴性载体对照组，VEGFR-2过表达组中mRNA表达显著升高(p＜0.001)，VEGFR-2沉默组的沉默效率均在50％以上(p＜0.001);相对阴性载体对照组，VEGFR-2过表达组中VEGFR-2蛋白表达显著升高(p＜0.05);VEGFR-2沉默组中VEGFR-2蛋白表达显著降低(p＜0.05)，两种细胞中VEGFR-2均成功实现有效的过表达与沉默，可用于后续实验。 2.在Hela与Siha细胞中，相对Control组，CCRT组与CCRT+E组显著抑制细胞增殖(p＜0.01);相对CCRT+NC+E组，CCRT+VEGFR2+E组更显著的抑制细胞增殖(p＜0.05)，而CCRT+KD-VEGFR2+E组抑制细胞增殖能力则较前下降(p＜0.05)。 3.在Hela与Siha细胞中，相对Control组，CCRT组与CCRT+E组中细胞凋亡显著增加(p＜0.01);相对CCRT+NC+E组，CCRT+VEGFR2+E组中细胞凋亡显著增加(p＜0.01)，而CCRT+KD-VEGFR2+E组中细胞凋亡较前减少(p＜0.05)。 4.在Huvec细胞中，相对Control组，CCRT组与CCRT+E组显著抑制血管内皮细胞血管形成(p＜0.01)，其中CCRT+E组抑制更明显;相对CCRT+NC+E组，在VEGFR-2过表达后，CCRT+VEGFR2+E组更显著的抑制血管内皮细胞血管形成(p＜0.01)，在VEGFR-2沉默后，CCRT+KD-VEGFR2+E组抑制血管内皮细胞血管形成的能力减弱(p＜0.05);相对Control组，CCRT组与CCRT+E组显著抑制CD31表达(p＜0.01)，其中，以CCRT+E组抑制更明显;相对CCRT+NC+E组，CCRT+VEGFR2+E组显著抑制CD31表达(p＜0.01)，而CCRT+KD-VEGFR2+E组抑制CD31表达的能力减弱(p＜0.05)。 5.相对Control组，CCRT组与CCRT+E组显著抑制裸鼠瘤体体积(p＜0.01);相对CCRT+NC+E组，CCRT+VEGFR2+E组显著抑制瘤体体积(p＜0.05)，而CCRT+KD-VEGFR2+E组抑制瘤体体积能力较前下降(p＜0.05)。相对Control组，CCRT组与CCRT+E组显著抑制CD31的表达(p＜0.05，p＜0.001)，相对CCRT+NC+E组，CCRT+VEGFR2+E组显著抑制CD31表达(p＜0.05)，而CCRT+KD-VEGFR2+E组较CCRT+VEGFR2+E组抑制CD31表达的能力减弱。 6.在不同浓度的恩度处理Hela细胞后，随着浓度增加，VEGF表达显著降低(p＜0.05)。相对Control组，VEGF蛋白在4h、8h时显著降低(p＜0.05);随着恩度浓度增加，细胞核内VEGF表达显著降低(p＜0.05)而细胞质内VEGF表达显著增加(p＜0.05)。 7.在Input样本中可以检测到VEGF与VEGFR-2;IP实验发现，Control组和恩度处理组中均可以检测到VEGFR-2蛋白，Control组中可以检测到VEGF蛋白，而恩度处理组中无法检测到VEGF蛋白。Pulldown实验结果显示，在Input样本中可以检测到VEGF与VEGFR-2的标记蛋白Flag与GST;采用VEGFR-2标记蛋白Flag抗体进行IP实验发现，Control组和恩度处理组中均可以检测到VEGFR-2蛋白，Control组中可以检测到VEGF蛋白，而恩度处理组中无法检测到VEGF蛋白。 结论 本研究发现，VEGFR-2促进恩度联合化放疗的体外宫颈癌细胞抑制，而恩度通过促进VEGF的细胞质转移和缩短其蛋白半衰期从而抑制VEGF表达，以及通过调控VEGF与VEGFR-2的互作关系抑制血管形成。本研究有望为临床上采用恩度联合同步化放疗方案治疗宫颈癌提供新的理论与新的策略。
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