摘要
溶藻弧菌（Vibrioalginolyticus）是引起海水养殖动物细菌性疾病的主要病原菌之一，经常给水产养殖业造成巨大的经济损失。溶藻弧菌III型分泌系统（TypeIIIsecretionsystem,T3SS）是其重要的致病系统。T3SS是保守的注射装置，可插入宿主细胞膜把毒力蛋白注入细胞内，导致细胞死亡。在T3SS注射毒力蛋白过程中，针尖的转位子蛋白VopB、VopD和VcrV先在宿主细胞膜上成孔是致病的前提，但它们在溶藻弧菌致病性中的作用尚不清楚。因此，本研究利用同源重组技术，构建溶藻弧菌的缺失株ΔvopB、ΔvopD、ΔvopB-D和ΔvcrV，研究各缺失株的生物学特性和致病力，并通过转录组、蛋白质组和代谢组关联分析，探讨溶藻弧菌转位子基因vopB、vopD和vcrV的功能。主要结果如下： 1.转位子基因vopB、vopD和vcrV的克隆及缺失株ΔvopB、ΔvopD、vopB-D和ΔvcrV的构建 克隆vopB、vopD和vcrV基因并进行生物信息学分析，结果显示，各基因的碱基序列长度分别为1200bp、1005bp和1824bp，3个基因的氨基酸序列均与魔鬼弧菌和副溶血弧菌聚为一支。用同源重组技术成功构建缺失株ΔvopB、ΔvopD、ΔvopB-D和ΔvcrV。遗传稳定性检测显示，各缺失株遗传稳定。 2.缺失株ΔvopB、ΔvopD、ΔvopB-D和ΔvcrV的生物学特性研究 缺失株ΔvopB、ΔvopD、ΔvopB-D和ΔvcrV的生物学研究显示，各缺失株的生长、自凝集能力和胞外酶活性无显著变化。各缺失株的游动和涌动能力均增强，而毒力、细胞粘附力和抗氧化能力均减弱。缺失株ΔvopB和ΔvopD的生物膜形成能力增强，而ΔvopB-D和ΔvcrV则减弱。缺失株ΔvopB、ΔvopD和ΔvopB-D的耐盐和耐重金属能力均增强，ΔvcrV的耐盐性减弱。除ΔvopB的葡萄糖不变和ΔvcrV的活性氧降低外，各缺失株的活性氧、超氧化物歧化酶、过氧化氢酶、谷胱甘肽过氧化物酶、β-内酰胺酶、肽聚糖、还原型辅酶Ⅱ、精氨酸、脯氨酸、组氨酸、谷氨酰胺、ATP、葡萄糖指标均升高。ΔvopB和ΔvopD对喹诺酮类和β-内酰胺类的头孢唑林与头孢哌酮敏感性减弱，ΔvopB对头孢氨苄敏感性增强，ΔvopD对头孢呋辛敏感性增强。ΔvopB-D除部分青霉素类和喹诺酮类外，对大多数药物敏感性均增强。ΔvcrV对部分β-内酰胺类的头孢类敏感性增强，对喹诺酮类敏感性减弱。缺失株ΔvopB、ΔvopB-D和ΔvcrV的鞭毛相关基因flaB、fliG和耐药相关基因ompU、emrD、vemD、CARB-6、pbp1a/2、dacA表达均上调。ΔvopD的鞭毛相关基因flaB、flaG、fliG和耐药相关基因ompU、CARB-6表达上调，而fliG、emrD、vemD、pbp1a/2则下调。表明vopB、vopD和vcrV基因参与溶藻弧菌T3SS的致病性和多种生理功能，具有重要的生物学意义。 3.缺失株ΔvopB、ΔvopD、ΔvopB-D和ΔvcrV对斑马鱼免疫效果分析 用低浓度的缺失株ΔvopB、ΔvopD、ΔvopB-D和ΔvcrV肌肉注射免疫斑马鱼，获得的免疫保护率分别为52.9%、70.5%、82.4%、64.7%。ΔvopB和ΔvopD免疫组均下调斑马鱼肝脏免疫蛋白IgM、C3a基因，炎症因子TNF-α、TLR5、IL-6R、IL-6、IL-8、IL-1β、C/EPBβ基因，抗氧化酶Sod1、Cat1、Gpx1a、GSTR基因及溶菌酶Lyz基因。ΔvopB-D免疫组仅IgM基因表达上调，其他免疫和抗氧化相关基因均下调。ΔvcrV免疫组IL-1β和C3a基因表达不变，其他免疫和抗氧化相关基因均下调。斑马鱼肝脏生化及酶活指标显示，各免疫组的IgM、GPX和MDA指标均升高。其中ΔvopB免疫组的IL-6、TNF-α、SOD、GST、LZM指标降低；ΔvopD免疫组的TNF-α、SOD、GST、CAT指标降低，C3a、LZM指标升高；ΔvopB-D免疫组的IL-6、TNF-α指标降低，SOD、GST、CAT指标升高；ΔvcrV免疫组的IL-6、CAT、LZM指标降低，C3a、SOD、GST指标升高。表明各缺失株免疫斑马鱼影响了其免疫和抗氧化系统。 4.vopB、vopD和vcrV对耐药、抗氧化和运动等相关基因的调控 对缺失株ΔvopB、ΔvopD、ΔvopB-D、ΔvcrV进行转录组、蛋白质组和代谢组检测显示，各缺失株的差异基因分别为2618、2053、1578、1557个；差异蛋白分别为335、250、283、545个；差异代谢物分别为32、49、77、70个。组学关联分析显示，转位子基因vopB、vopD和vcrV的缺失，主要影响溶藻弧菌的β-内酰胺耐药性、细菌运动与鞭毛组装、抗氧化系统、肽聚糖代谢、氨基酸代谢、抗生素合成、T2SS和T6SS等相关基因的表达。
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