摘要
研究背景和目的 口腔遗传性疾病是指主要病变在口腔组织的遗传病，如发生于口腔局部的牙本质发育不全、缺牙等;一些系统性疾病也可累及口腔组织，如先天性外胚叶发育不全、成骨不全、颅骨锁骨发育不良等。口腔遗传病的种类多样，主要的致病原因是遗传因素。罹患疾病的患者生活质量明显降低，因此其病因的寻找成为患者和许多研究学者共同关注的热点。 本研究收集到四个无血缘关系的来自全国各地的牙数目发育异常（包括两例先天性缺牙和一例颅骨锁骨发育不良综合征伴多生牙）和一例非综合征型牙本质发育不全口腔遗传病家系，借助全外显子测序和Sanger测序针对每个疾病的相关候选基因进行检测并分析其功能改变，探讨突变基因的致病机理，为口腔遗传病的深入研究打下理论基础。 材料与方法 1.收集具有先天性牙数目异常、牙本质发育异常或伴综合征型临床表现的口腔遗传病家系，整理临床资料和采集外周血。 2.对于入选的患者进行全外显子测序(WES)，利用Sanger测序对筛查结果分析及验证。 3.利用SOPMA、I-TASSER、Polyphen2等软件分析致病基因变异对蛋白功能的影响。 4.构建目的基因的野生型(WT)和突变型(MUT)表达载体，转染至HEK-293t细胞或人牙髓干细胞(hDPSCs)，RT-qPCR和WesternBlot技术检测突变基因的表达情况。共聚焦显微镜下观察突变蛋白在细胞中的定位。 5.对收集到的患者的离体磨牙，采用Micro-CT、甲苯胺染色、扫描电镜和纳米压痕等技术对牙齿进行超微结构分析;培养患者原代hDPSCs，探究其成牙本质分化能力的变化。 6.对X染色体遗传模式的遗传病，采用雄激素受体基因分析方法检测女性致病基因携带者的X染色体失活类型。 结果 1.本研究通过WES在四个中国汉族的口腔遗传病家系中筛查到了一个已知的致病基因位点和3个新变异位点并进行实验验证，涉及的致病基因包括COL1A1基因、KDF1基因、EDA基因和RUNX2基因。 2.在家系一中筛查到一个COL1A1的新发变异位点(c.1463G＞C，p.G488A)，患者表现为非综合征型的牙本质发育不全;该变异预测为有害突变，蛋白三级结构及蛋白表达水平发生变化;超微结构分析显示患者牙本质小管数目稀疏、闭塞，成牙本质细胞层紊乱、极性消失，牙本质硬度降低以及hDPSCs过度矿化等特征。 3.在家系二中筛查到一个KDF1的新发变异位点(c.911T＞A，p.I304N)，患者临床表现为严重的单纯型的全部恒牙牙胚的缺失。该突变通过软件预测为有害突变，突变氨基酸在各物种中高度保守。突变影响了KDF1蛋白的二级和三级结构，也影响了其在mRNA和蛋白水平的表达。 4.在家系三中筛查到一个已知的EDA变异位点(c.1013C＞T，p.T338M)临床表现为男性患者多数牙缺失而女性患者则仅缺失恒牙一颗;突变影响了EDA在hDPSCs中的表达及导致NF-κB信号通路发生变化;在X染色体失活类型检测中发现，女性携带者存在轻微程度的偏移失活。 5.在家系四中的CCD患者中检测到一个RUNX2基因的新的缺失移码突变c.132delG，变异使RUNX2丧失多个功能域，生成只剩143个氨基酸残基(p.Val45TrpfsX98)的截短蛋白;变异使RUNX2蛋白的二级和三级结构发生明显变化，使RUNX2蛋白在细胞中的定位发生明显变化，呈点状聚集在细胞核中;并影响了其mRNA和蛋白表达水平。 结论 本研究在非综合征型的牙本质发育不全家系中发现了COL1A1的新发变异位点，为两者之间的联系增添了新的证据支持。在非综合征型先天性缺牙家系中发现一个EDA的已知变异位点和一个KDF1的新发突变位点，探讨了EDA在hDPSCs中可能影响机制和X染色体失活在疾病中的影响作用，也首次报道了KDF1基因突变可导致非综合征型无牙症。在罕见的CCD中发现了新的缺失移码突变，为患者家系成员提供了遗传咨询及优生指导。
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