摘要
结直肠癌作为最常见的消化道肿瘤，目前其发病率和死亡率占据所有恶性肿瘤的第三位，成为威胁全球公民生命健康的重大问题。在中国，结直肠癌的发病率和致死率位于所有恶性肿瘤的前五，而且其发病率有逐年攀升的趋势。由于结直肠癌是一种在基因组和转录组具有高度异质性的恶性疾病，因此无法制定标准而有效的联合治疗方案。目前，虽然针对结直肠癌的发病机理研发了很多治疗结直肠癌的分子靶向药物，但是治疗效果显著且同时减轻顺铂化疗耐药的药物却是凤毛麟角。鉴于结直肠癌发病的隐匿性，病理机制的复杂性，治疗手段的局限性，我们需要寻找新的诊断和治疗的分子靶点。 泛素特异性蛋白酶39(USP39)作为泛素特异性蛋白酶家族的一员，主要表达在细胞核，在卵巢癌、肝癌等多种癌症中表达异常升高，参与多种生物学功能，如细胞增殖、细胞周期进程、细胞凋亡、细胞侵袭转移及前体mRNA的剪接成熟过程，提示USP39可能是一个抗癌治疗的潜在靶点。然而，USP39与结肠癌发生发展的作用机理，目前尚无深入研究。本论文以结肠癌细胞及动物模型为研究对象，阐明USP39在结肠癌发生发展中的作用机制及其对顺铂化疗敏感性影响的机制，为USP39作为结肠癌新的治疗靶点提供理论基础。 本论文主要探讨了USP39调控结肠癌细胞增殖及其顺铂化疗敏感性的分子机制，本研究主要包括以下两个部分。 第一部主要探究USP39调控结肠癌细胞生长的功能和分子机制。 (1)通过结肠癌在线数据库和组织芯片分析，发现USP39在结肠癌组织中的表达明显高于癌旁组织，且该结果也在结肠癌细胞中得以进一步验证。 (2)以HCT116、SW620和RKO细胞为研究对象，通过MTT、克隆形成实验、细胞周期实验和裸鼠皮下成瘤实验，证实敲低USP39可显著抑制结肠癌细胞的增殖、集落形成、诱导S、G2/M周期阻滞以及裸鼠皮下肿瘤的生长，且回补USP39可一定程度修复结肠癌细胞的增殖活性。 (3)以HCT116、HCT116p21null和293T细胞为研究对象，通过常规细胞学实验以及CO-IP、IF、LUC实验，证明USP39调控结肠癌增殖是依赖于p21，主要的分子机制是:一、敲低USP39可延长p21蛋白半衰期;二、USP39可与p21相结合，抑制p21启动子活性，进而抑制其转录，使p21蛋白表达下调。其中，USP39的RS结构域和USP结构域发挥着重要作用。 (4)另外，通过RNA-seq测序结果对剪接事件的分析发现，USP39可发挥其作为剪接因子相关蛋白的作用，敲低USP39可使细胞凋亡相关基因SKP1、Bax和BMF发生可变剪接，破坏其mRNA正常剪接秩序，进而使其转录水平上调。 第二部分主要探讨了USP39调控结肠癌细胞顺铂化疗敏感性的功能和机制。 (1)以HCT116、RKO细胞为研究对象，通过MTT实验检测结肠癌细胞对于顺铂的IC50，发现USP39表达差异与结肠癌细胞顺铂化疗敏感性有关，且USP39可负向调控结肠癌对于顺铂的敏感性。 (2)通过PI/AnnexinV-APC双染检测细胞凋亡实验和裸鼠皮下荷瘤实验，证明敲低USP39可通过诱导凋亡增强结肠癌细胞对于顺铂的敏感性，且敲低USP39可增强顺铂对于皮下移植瘤的治疗效果。 (3)通过ROS检测、细胞免疫荧光实验，发现敲低USP39可增强顺铂诱导的结肠癌细胞的DNA损伤反应和氧化应激反应，且该功能是依赖于p53。具体分子机制是:敲低USP39可延长p53蛋白半衰期，同时上调p53的转录激活活性，维持p53蛋白稳定性，进而增强结肠癌细胞对于顺铂化疗的敏感性。 综上，本论文从细胞水平、动物水平以及临床样本三个层面，证实敲低USP39可抑制结肠癌生长、皮下成瘤以及增强结肠癌对于顺铂治疗的敏感性。具体机制是:USP39可通过负向调控p21启动子活性和p53的转录激活活性，DNA损伤反应及氧化应激反应，从而促进结肠癌的发生发展及顺铂耐药的产生。USP39可作为结肠癌治疗的新的潜在分子靶点。
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