摘要
目的:建立SD大鼠股骨骨折模型，从成骨效应，骨代谢以及分子水平研究西伯利亚接骨木树皮提取物对骨折愈合的作用及机制，为临床用药和进一步开发利用提供理论基础。方法:第一部分:将108只3月龄雄性SD大鼠随机分为5组，除了假手术组12只，其余每个组24只，分别为:假手术组，模型组，醇提组，水提组，阳性对照组（给中华跌打丸）。给药2、4、6周后随机取4只SD大鼠，运用X射线、Micro-CT、生物力学实验、以及组织学方法评估接骨木树皮提取物对大鼠股骨骨折愈合的成骨效应。第二部分:给药2、4、6周后随机取4只SD大鼠，取血样本，用酶联免疫法测定大鼠血清中骨代谢生化指标骨钙素(BGP)、骨保护素(OPG)、Ⅰ型胶原羧基端肽(PICP)、碱性磷酸酶(ALP)、酸性磷酸酶(ACP)、钙(Ca)、磷(P)的水平。第三部分:通过RT-PCR、WesternBlot、免疫组织化学评估接骨木树皮提取物对Wnt/β-catenin信号通路和生长因子的影响。结果:第一部分:①X射线检查结果:给药第2周时，模型组骨折线明显，而醇提组、水提组，阳性对照组骨折线模糊，可见纤维性骨痂。第4周，模型组骨折线变模糊，有少量骨痂形成，而醇提组、水提组，阳性对照组有大量骨痂形成，骨折线较模糊。第6周，醇提组、水提组，阳性对照组有大量骨性骨痂形成并骨痂塑形，髓腔再通，骨折线消失，与阳性对照组比较，醇提组评分明显高，而模型组较欠佳。②MicroCT检测:实验结果显示在第2，4，6周，接骨木树皮提取物给药组（如醇提组和水提组）BMD、BV/TV、Tb.Th、Tb.N都高于模型组，差异有统计学意义（P＜0.05），与模型组比较，醇提组和水提组骨小梁数量多，并且其骨小梁的厚度也大，从微观结构上表明醇提组和水提组愈合优于模型组。③生物力学实验:醇提组和水提组的最大载荷值、最大挠度值均显著优于模型组。④组织切片结果提示:第2周，醇提组、水提组均出现少量软骨细胞，大量间充质细胞、成纤维细胞、单核巨噬细胞、成骨细胞、骨细胞、以及新生血管等开始形成排列紧密的纤维结缔组织，使骨折断段初步链接在一起:而模型组有少量间充质细胞、成骨细胞和骨细胞，出现成纤维细胞和炎性细胞形成的肉芽组织和排列松散的纤维结缔组织。第4周，醇提组、水提组大鼠骨折处均可见大量软骨细胞、成骨细胞和破骨细胞形成，骨折断端及骨膜下有较多类骨质出现:而模型组可见少量的软骨细胞和成骨细胞，骨折断端由排列紧密的纤维结缔组织连接在一起。第6周，醇提组、水提组类骨质增多，骨小梁相互连接向板层骨转变，成骨过程明显:而模组骨折端可见较少的类骨质和少量的新生骨小梁。第二部分:药物干预第2周时，与假手术组比较，模型组大鼠血清ALP、OPG、ACP、BGP、PICP、Ca、P水平升高，差异有统计学意义(P＜0.05)，这说明造模成功;第4、6周时，与模型组比较，阳性对照组，醇提组，水提组大鼠血清ALP、ACP、BGP、PICP、P水平显著增高，差异有统计学意义(P＜0.01，P＜0.05)，醇提组和水提组血清中Ca水平显著降低，差异有统计学意义(P＜0.05)。组间比较，血清ALP、ACP、BGP、PICP在愈合过程中有降低的趋势，而血清OPG有升高的趋势，差异有统计学意义(P＜0.05)第三部分:①运用RT-PCR和WesternBlot技术验证，研究发现，与模型组相比，Wnt2、β-catenin、p-GSK3β在醇提组和水提组中蛋白表达量显著升高，差异有统计学意义(P＜0.05)。②与模型组相比，骨形态发生蛋白2(BMP-2)和血管内皮生长因子(VEGF)在醇提组和水提组中的表达量显著增高，第2、4周逐渐上升，第4周达到高峰，第6周成骨细胞成熟、骨痂形成而逐渐减少。结论:从大体标本观察，X射线、Micro-CT、生物力学、以及组织学方法证实了接骨木树皮提取物具有良好的成骨效应，能够增大骨痂体积、提高骨密度，促使骨痂连接，增加骨小梁数量和骨小梁厚度，提高骨痂最大载荷强度与韧度，加快骨折愈合速度;接骨木能够增高骨代谢标志物水平，提高血磷水平，促使血钙沉积，促进血液微量元素的吸收、提高骨密度，促进骨折修复;实验证实接骨木树皮提取物激活Wnt/β-catenin信号通路，分泌多种生长因子，如BMP-2、VEGF，进行成骨分化，促进钙化软骨骨沉积，钙化的软骨最终重塑并骨化，完成修复过程，从而促进骨折的愈合。
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